par Virgilio, Enrico 
Président du jury Corazza, Francis
Promoteur Cnop, Miriam
Publication Non publié, 2026-02-13
Président du jury Corazza, Francis
Promoteur Cnop, Miriam
Publication Non publié, 2026-02-13
Thèse de doctorat
| Résumé : | In vitro differentiation of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into β cells constitutes an invaluable cell source for research. We employed a 7-stage differentiation protocol to differentiate iPSCs into islet-like aggregates, that were subsequently characterized. The last three stages of differentiation were carried out in two different 3D environments: a rotating suspension or a microwell plate. The two 3D methods showed a similar β cell differentiation efficiency, but microwell aggregates displayed a homogeneous small-size with a high experimental success rate, compared to the heterogeneous size of the rotating suspension aggregates, often subject to clumping. In both cases, the in vitro differentiation generated aggregates lacking adequate glucose responsiveness.Monogenic form of diabetes are rare form of diabetes caused by a single gene mutation. Comprehending the genetic causes underlying them is of particular interest, as they reveal essential pathways for the development, function and survival of the pancreatic β cells. Indeed, they can be seen as “human knockout” models generated by nature. Moreover, evidence shows that there is a certain degree of overlap between genes causing monogenic diabetes and conferring specific risk to the more common polygenic forms of diabetes. This points towards shared relevant pathways in their pathology. We investigated the pathogenetic role of ER stress and the ER-to-Golgi pathway trafficking in β cells by researching a newly discovered syndrome involving neonatal diabetes, microcephaly and epilepsy, caused by biallelic loss of function mutations in TMEM167A. Functional characterisation of this novel disease gene was performed by employing in vitro knockdown or by inserting with CRISPR-Cas9 genome editing a patient’ specific mutation into healthy iPSCs prior differentiation into β cells. Mutant β cells displayed an impaired proinsulin trafficking, were dysfunctional and sensitized to ER stress-induced apoptosis. Altogether, our findings support the notion that the ER stress and ER-to-Golgi trafficking pathways are crucial in β cells. Modulating these two pathways may hold substantial therapeutic potential for diabetes and for other ER stress-related diseases.La différenciation in vitro de cellules souches pluripotentes induites humaines (CSPi) en cellules β constitue une source cellulaire précieuse pour la recherche. Nous avons utilisé un protocole de différenciation en 7 étapes pour différencier les CSPi en agrégats de type îlots, qui ont ensuite été caractérisés. Les trois dernières étapes de différenciation ont été réalisées dans deux environnements 3D différents : une suspension en rotation ou une plaque de micropuits. Les deux méthodes 3D ont montré une efficacité de différenciation des cellules β similaire, mais les agrégats en micropuits présentaient une petite taille homogène avec un taux de réussite expérimental élevé, comparés à la taille hétérogène des agrégats en suspension en rotation, souvent sujets à l'agglutination. Dans les deux cas, la différenciation in vitro a généré des agrégats présentant une sensibilité insuffisante au glucose.Les formes monogéniques de diabète sont des formes rares de diabète causées par une mutation d'un seul gène. La compréhension des causes génétiques sous-jacentes est particulièrement intéressante, car elles révèlent des voies essentielles au développement, à la fonction et à la survie des cellules β pancréatiques. En effet, ils peuvent être considérés comme des modèles de « knock-out humain » générés par la nature. De plus, des données probantes montrent qu'il existe un certain degré de chevauchement entre les gènes responsables du diabète monogénique et conférant un risque spécifique aux formes polygéniques plus courantes de diabète. Cela suggère des voies communes pertinentes dans leur pathologie. Nous avons étudié le rôle pathogénique du stress du RE et du trafic de la voie RE-Golgi dans les cellules β en étudiant un syndrome récemment découvert impliquant le diabète néonatal, la microcéphalie et l'épilepsie, causé par des mutations bialléliques de perte de fonction du gène TMEM167A. La caractérisation fonctionnelle de ce nouveau gène pathogène a été réalisée par knock-down in vitro ou par insertion, par édition du génome CRISPR-Cas9, d'une mutation spécifique du patient dans des cellules iPS saines avant différenciation en cellules β. Les cellules β mutantes présentaient un trafic de proinsuline altéré, étaient dysfonctionnelles et sensibilisées à l'apoptose induite par le stress du RE. Dans l'ensemble, nos résultats soutiennent l'idée que le stress du RE et les voies de transport du RE vers le Golgi sont essentiels dans les cellules β. La modulation de ces deux voies pourrait présenter un potentiel thérapeutique important pour le diabète et d'autres maladies liées au stress du RE. |
