• Citer

Structural and conformational studies of MFS multidrug transporters QacA and LmrP

par Jodaitis, Léni
Président du jury Raussens, Vincent
Promoteur Govaerts, Cédric
Publication Non publié, 2023-09-08

Thèse de doctorat

• Accès en ligne
• Détails
• Contenu
• Statistiques

Résumé :

This thesis focuses on elucidating the transport mechanism of two multidrug transporters, QacA and LmrP, belonging to the major facilitator superfamily (MFS).QacA is a protein mediating antibiotic resistance from Staphylococcus aureus. Unravelling the structural insight of the protein might lead to a better understanding of the extrusion pathway of QacA. Crystallization trials yielded multiples diffracting crystals and four different structures were obtained in different conformations and with different substrates. QacA was first obtained in an outward open conformation at a resolution of 2.8 Å then in inward open state by co-crystallization with a nanobody at 3.3 Å. Out of five crystals obtained with different substrate, two were selected. The first one revealed an Ethidium bound QacA at 2.8 Å and demonstrated high flexibility of one specific transmembrane helix. The other one was co-crystallized with chlorhexidine, a divalent cationic molecule used in disinfectant. The obtained structure at 3.9 Å showed an intermediate state of the protein with the substrate outside of the primarily defined binding pocket. By combining the knowledge acquired on our crystal structures with mutagenesis, molecular dynamics simulations, and HDX-MS, we proposed a model of transport of the protein. This model significantly addresses the outstanding questions regarding QacA protein. The cumulative evidence suggests that QacA's conformational changes may not rely solely on Motif A and that pH might not significantly impact the protein's conformational landscape. Instead, the interaction between the ligand or protonation of the binding site and the flexibility of the transmembrane domain appear to drive the conformational switch. The flexibility of key transmembrane domains facilitates polyspecificity, adaptability, and conformational transitions. Additionally, the presence of potential intermediate binding sites and numerous methionine residues enables stabilization of a wide range of molecules varying in shape and size within QacA.LmrP is a protein mediating antibiotic resistance from Lactococcus lactis. While the structure of LmrP in the outward open state has been previously published, the other conformational state of the protein remained unknown. Various strategies were explored to induce and crystallize an alternative conformation of LmrP. Nanobodies, known for stabilizing transient protein states, were tested, and a specific nanobody called nbH4 exhibited promising results in stabilizing the inward open or occluded states. Crystallography studies involved mutagenesis, substrate screening, and nanobody co-crystallization. Unfortunately, crystals of LmrP in an alternative conformation were not obtained and an alternative technique was considered, Cryo-EM. As cryo-electron microscopy is limited by the size of the sample (>100kDa), megabodies, chimeric proteins comprising nanobodies and scaffold proteins, were also developed to enhance the size of LmrP complexes. Sample optimization using nanodiscs facilitated the visualization of the protein under the microscope and a 3D reconstruction of the overall complex was obtained. However, the inherent flexibility of the megabodies limited the tridimensional resolution of the final model and LmrP in the other conformational state remained unresolved. This work has thus increased our knowledge on how to promote specific conformation of membrane protein, gave insight on how to observe small particles in cryo-EM and has attempted to explain the amazing polyspecificity and extrusion process of QacA, one of the most important antibiotic mediating resistance proteins from Staphylococcus aureus.

Cette étude discute de la structure et de la dynamique de deux protéines membranaires, QacA et LmrP. Tous deux sont des exporteurs d’antibiotiques capables de conférer une résistance non négligeable aux hôtes chez lequels ils sont exprimés. Cette étude discute de la structure et de la dynamique de deux protéines membranaires, QacA et LmrP. Tous deux sont des exporteurs d’antibiotiques capables de conférer une résistance non négligeable aux hôtes chez lesquels ils sont exprimés. LmrP est une protéine exprimée par Lactoccocus Lactis. Une première structure de la protéine dans un état « ouvert vers le milieu extracellulaire » (OE) a été obtenue dans notre laboratoire. Mes recherches avaient pour but d’obtenir d’autres états de la protéine en utilisant des stabilisateurs conformationnels appelés nanobodies (nb). Une étude approfondie de ces outils biologiques en termes de stabilité, d’affinité et de capacité à stabiliser des états alternatifs a été réalisée. Un candidat potentiel, le “nb-H4” a été sélectionné car lors de la formation du complexe avec LmrP un état différent de l’OE a été mesuré. Le nb-H4 a aussi été transformé en mégabody H4 (MB-H4), résultat de la fusion génétique du nanobody avec une grosse protéine stable. Ce MB-H4 est un outil qui permettra l’étude de LmrP sous le cryo-électromicroscope afin de tenter d’obtenir sa structure par une méthode différente de la cristallographie. En effet, la formation d’un complexe entre LmrP et le MB-H4 permettra de créer une protéine assez grande que pour être observée sous le microscope. Bien que les résultats de l'étude structurelle par cristallographie et par cryo-electromicroscopie n'aient finalement pas abouti à l'obtention d'une nouvelle structure de LmrP, des avancées majeures en termes d'outils biologiques et de préparation d'échantillons ont été réalisées lors de cette étude de la protéine.QacA, qui est une protéine de Staphylococcus aureus, n'avait pas fait l'objet d'une recherche structurelle auparavant. Dans cette étude, nous avons établi une méthode efficace de production et de purification pour la cristallisation et avons obtenu plusieurs structures de QacA dans différentes conformations. Certaines de ces structures contiennent des substrats, ce qui nous a permis de définir une poche de liaison. En outre, différentes collaborations de modélisation moléculaire, de spectroscopie de masse ou de mutagenèse nous ont permis de mieux caractériser la protéine. Une étude complète de ses états, de ses transitions et de ses interactions avec les substrats a été effectuée, ce qui a conduit à la proposition d'un modèle de transport d'une protéine très importante dans la résistance antibiotique de Staph. Aureus. Au cours de l'étude de QacA, un nanobody en particulier pourrait être utilisé comme inhibiteur et pourrait mener à une réduction de la résistance antibiotique.