par De Timary Vanden Berghe De Binckum, Guillaume 
Président du jury Baeyens, Nicolas
Promoteur Scheid, Benoît
Publication Non publié, 2023-03-09
Président du jury Baeyens, Nicolas
Promoteur Scheid, Benoît
Publication Non publié, 2023-03-09
Thèse de doctorat
| Résumé : | Dans cette thèse, nous étudions la possibilité d’utiliser la microfluidique pour l’analyse par cellule unique de la persistance bactérienne, un trait phénotypique rare (1/1 000 - 10 000)et mal compris qui permet à certaines bactéries de tolérer le contact avec un dose létale d’antibiotique. A la suite d’un traitement antibiotique, les cellules persistantes s’allongent tandis que les cellules sensibles mortes gardent leur forme ovoïde. Notre stratégie consiste à exploiter cette distinction morphologique afin d’isoler les cellules persistantes du reste de la population. En effet, nous ambitionnons de récolter un échantillon ultra pur de cellules persistantes qui sera analysé afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacent à la persistance bactérienne. Nous envisageons deux méthodes microfluidiques distinctes afin d’y parvenir. Tout d’abord, nous élargissons le domaine d’application de la mother machine. Ce dispositif permet de capturer simultanément des milliers de cellules au sein de canaux-piège afin de surveiller leur croissance individuelle en temps réel. La persistance bactérienne et la filamentation des cellules sont ensuite induites par traitement antibiotique et les cellules persistantes filamenteuses peuvent alors être extraites des canaux-piège par cisaillement afin d’être récoltées à la sortie de la mother machine. Pour concevoir ce dispositif, nous avons dû repousser les limites du Nanoscribe Photonics Professional GT2, une imprimante 3D à haute résolution. Ensuite, nous étudions l’influence du débit sur la trajectoire de particules à flottabilité neutre, ainsi que sur la trajectoire de cellules filamenteuses et ovoïdes dans un dispositif de pinch flow fractionation (PFF). Nos simulations et nos expériences mettent en lumière les principales différences entre les forces hydrodynamiques agissant sur des particules sphériques et celles agissant sur des particules axisymétriques non sphériques dans un dispositif de PFF. En effet, au-delà d’un certain débit, l’inertie des particules sphériques leur permet de traverser des lignes de courant en réponse à un brusque changement de direction de l’écoulement. Ces évènements, combinés à l’effet croissant des forces de portance inertielle dévient les particules de la trajectoire que suivrait une particule de même dimension sans inertie. En parallèle, les cellules filamenteuses adoptent différents modes de rotations générés par le cisaillement et la présence du mur adjacent, ce qui dévie leur trajectoire vers le centre du canal. Nos résultats révèlent que l’amplitude de cette déviation diminue lorsque le cisaillement augmente, de sorte que la trajectoire des cellules est également fortement influencée par le débit dans le système. En conséquence, nous montrons qu’il est possible de moduler les conditions d’écoulement afin d’améliorer significativement la séparation des particules selon un critère de taille et de forme en PFF. En nous appuyant sur ces observations, nous utilisons la méthode de pinch flow fractionation pour extraire un échantillon de cellules filamenteuses ultra pur d’une population bactérienne essentiellement composée de cellules ovoïdes. |
| In this thesis, we propose to use microfluidic tools to perform single-cell analysis of bacterial persistence, a rare (1/1,000 - 10,000) and fairly misunderstood phenotypic switch, that enables individual bacteria to tolerate antibiotics. After antibiotic treatment, persister cells elongate while the rest of the antibiotic sensitive cells are dead and keep their initial ovoid shape. We plan to take advantage of this morphological distinction to isolate the persister cells from the rest of the population using two different approaches. Thereby, we aim at collecting an ultra high purity sample of persister cells, which could be analyzed to further understand the molecular mechanisms behind this phenotypic switch. As first approach, we extend the scope of the well-known mother machine, in which thousands of bacteria are trapped individually inside growth channels, enabling for their growth to be monitored at the single-cell level. Bacterial persistence and filamentation can be induced inside the device with an antibiotic and the filamentous cells can then be extracted from the growth channel by shear and collected at the outlet of the system. The conception of this device led us to go beyond the limits of the high-resolution 3D printer Nanoscribe Photonics Professional GT2. As a second approach, we study the influence of the flow conditions on the trajectory of neutrally buoyant spherical particles, and of filamentous and ovoid cells in a pinch flow fractionation (PFF) device. Our simulations and experiments provide insights into the differences between the hydrodynamic forces acting on spherical and elongated axisymmetric particles in a PFF device. Indeed, above a certain flow rate, the inertia of the spherical particles enables them to cross streamlines in response to an abrupt change in the flow direction. These streamline crossing events combined with the increasing effect of the inertial lift forces drive particles to deflect from the inertialess trajectory. Conversely, the shear rate and the interactions with the nearest wall lead filamentous cells to adopt various rotational motions, which deviate them towards the centre of the channel. Our results show that increasing the shear reduces the amplitude of this transversal deviation such that the cells trajectory is also strongly influenced by the flow rate. These findings enable us to significantly improve particles separation according to their size and shape in PFF by optimizing the flow conditions. Using PFF, we eventually succeed to extract an ultra high purity sample of filamentous cells from a solution containing mainly ovoid cells. |
