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Etude infrarouge à l’échelle nanométrique des structures agrégées du peptide Aβ impliquées dans la maladie d’Alzheimer: Nanoscale infrared study of aggregated form of Aβ peptide involved in Alzheimer disease

par Waeytens, Jehan
Président du jury Goormaghtigh, Erik
Promoteur Raussens, Vincent ;Dazzi, Alexandre
Publication Non publié, 2022-01-27

Thèse de doctorat

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Résumé :

RésuméLa maladie d’Alzheimer (MA) est la forme de démence sénile la plus courante. La maladie se caractérise par des dépôts de fibrilles d’amyloïde dans les espaces extraneuronaux. Les plaques fibrillaires amyloïdes sont composées majoritairement du peptide amyloïde Beta (Aβ). Aβ peut également former des agrégats solubles dénommés oligomères. Ces oligomères sont plus toxiques que les fibrilles. Néanmoins, les fibrilles induisent une réponse inflammatoire qui contribue à la toxicité du peptide. Il existe également des variants du peptide Aβ impliqués dans des pathologies associées à la MA tel que la forme précoce de la maladie d’Alzheimer et l’angiopathie amyloïde cérébrale. Ces variants comportent une mutation ponctuelle dans le peptide. L’agrégation de ces variants est moins connues et leurs implications dans des pathologies autres que la MA suggèrent des mécanismes d’agrégation différents. Pour pouvoir étudier l’agrégation des peptides, nous avons développé une méthode de production et purification de ces peptides en utilisant un système recombinant dans des bactéries E. Coli. Les variants ont quant à eux été obtenus par mutation par PCR dirigée. L’ensemble des peptides sont purifiés sur résine Ni-NTA.Ensuite, nous avons étudié les fibrilles amyloïdes d’Aβ par d’une technique récente de caractérisation couplant la microscopie à force atomique (AFM) avec l’analyse infrarouge (AFM-IR) et permettant d’étudier la structure secondaire des agrégats à l’échelle nanométrique, afin de mieux comprendre les effets des différents modes d’illumination, du substrat ou encore de l’exaltation du champ électrique lors de l’utilisation d’une pointe recouverte d’or, paramètres essentiels en AFM-IR. Nous avons déterminé la configuration optimale pour l’analyse spécifique des fibrilles amyloïdes et confirmés par l’étude de 3 autres fibrilles.Pour étendre les possibilités de l’AFM-IR et nous assurer de sa fiabilité, nous avons également réaliser un modèle de prédiction des structures secondaires de protéines solubles de structures connues. Une trentaine de protéines ont été analysées afin de créer un modèle de prédiction multivarié par AFM-IR et microscopie FTIR (µFTIR). Avec les deux techniques, le meilleur modèle de prédiction est obtenu par combinaison linéaire de longueurs d’onde avec une erreur de prédiction proche de 6 % pour les feuillets β et hélices α.Nous avons également étudié les cinétiques d’agrégation des variants d’Aβ par spectroscopie infrarouge, fluorescence à la Thioflavine T et par AFM. Ces techniques permettent de mieux comprendre les étapes de formations des fibrilles amyloïdes. La comparaison entre les peptides mutés et non mutés permet de mieux comprendre leurs implications dans les pathologies associées (angiopathie amyloïde cérébrale et maladie d’Alzheimer à début précoce). On observe peu de formation de fibrilles pour les mutants ainsi qu’une formation de feuillets β antiparallèles et une réponse plus faible à la ThT. Tout cela indique donc la formation principale d’oligomères ou protofibrilles. Finalement, nous avons étudié l’interaction entre les variants et des modèles de membranes lipidiques. L’étude de cette interaction est importante pour les variants impliqués dans l’angiopathie amyloïde cérébrale dont on sait qu’ils interagissent et fragilisent les parois des vaisseaux sanguins. Nous avons pu montrer que les variants en interaction avec les lipides forment des oligomères ou protofibrilles et non des fibrilles amyloïdes. L’interaction entre les membranes lipidiques et des fibrilles amyloïdes bactériennes fonctionnelles de la protéine Hfq a été étudiée comme comparaison avec les fibrilles amyloïdes pathogéniques. Les fibrilles d’Hfq montrent une décomposition en présence d’un lipide chargé négativement et une perturbation importante de la membrane lipidique similaire aux oligomères d’Aβ. AbstractAlzheimer’s disease (AD) is the most prevalent form of dementia. Fibrillar amyloid deposits in extra neuronal spaces characterize it. Amyloid plaques are composed essentially of the amyloid β peptide (Aβ). Aβ can also form soluble aggregates called oligomers. These oligomers are more toxic than fibrils. However, amyloid fibrils can induce inflammatory response, which contribute to the peptide’s toxicity. There are a series of Aβ variants due to point mutation in the peptide. Those are associated to early onset AD and cerebral amyloid angiopathy. The aggregation of these variants are less known and the implication of the variants in other pathologies than AD suggests different aggregation mechanisms.We have studied the aggregation of these peptides by following their secondary structure based on infrared spectroscopy (IR), the formation of amyloid fibrils based on Thioflavin T fluorescence (ThT) and their morphology based on atomic force microscopy (AFM). Moreover, we have also used a recent hyphenated technique coupling the AFM with infrared analysis (AFM-IR) that allows us studying the secondary structure of aggregates at nanoscale. To study the aggregation of peptides, we first need to develop a production and purification method for them. E. Coli bacteria are used for recombinant production of Aβ and purify on a Ni-NTA resin. The variants are they obtained by one site directed mutagenesis by PCR.Then, we realize a in depth study of amyloid fibrils by AFM-IR to better understand the effect of the illumination mode, substrate effect or the electric field enhancement due to gold coated tips. Those parameters are the major ones that can affect the spectra with the polarization. Based on our results, the ideal configuration for structure determination is the bottom-up illumination with silicon tip and s-polarization. The results were confirmed on three other amyloid fibrils.To extend the capacity of AFM-IR and ensure its reliability for protein study. We develop a prediction model for the secondary structure of soluble proteins with known structure. About thirty proteins were analyzed and multivariate models were developed by AFM-IR and microscopy FTIR (µFTIR). With both techniques, the best models of prediction are obtained by linear combination of wavenumbers with an error of prediction of about 6 % for β-sheet and α-helix. We also analyzed aggregation kinetics of Aβ and its variants by infrared spectroscopy, ThT fluorescence and atomic force microscopy. Those techniques allows better understanding of the key steps of amyloid fibril formation. The comparison between wild type and variants is important to understand better their implications in associated pathologies (cerebral amyloid angiopathy and early-onset Alzheimer disease). We observe only weak amyloid fibrils formation for the variants and a structure in antiparallel β-sheet and lower fluorescence with ThT. All these results indicate the main formation of oligomers and protofibrils. Finally, we study also the interaction of the variants with model lipidic membranes. This interaction is important to understand for the cerebral amyloid angiopathy as we know they interact and weakens blood vessel walls. We demonstrate that the variants interact with lipids and form oligomers or proto-fibrils without amyloid fibrils. We also study the interaction between lipidic membrane and bacterial amyloid fibrils to compare results with pathogenic amyloids. The Hfq fibrils show decomposition in presence of negatively charged lipid and perturbs the lipidic membrane like the Aβ oligomers.