par Hanthazi, Alienor 
Président du jury Langer, Ingrid
Promoteur McEntee, Kathleen
Co-Promoteur Dewachter, Laurence
Publication Non publié, 2021-09-03
Président du jury Langer, Ingrid
Promoteur McEntee, Kathleen
Co-Promoteur Dewachter, Laurence
Publication Non publié, 2021-09-03
Thèse de doctorat
| Résumé : | La chémérine est une adipokine, initialement décrite comme jouant des rôles centraux dans la régulation de l’adipogenèse, du métabolisme énergétique et de la réponse immunitaire. Plus récemment, elle a été incriminée dans le contrôle de la pression systémique, agissant sur le tonus et le remodelage des artères systémiques. La chémérine interagit avec les cellules en se fixant sur trois récepteurs, le CMKLR1 (chemokine like receptor 1), GPR1 (G protein- coupled receptor 1) et CCRL2 (C-C chemokine receptor-like 2). Le CMKLR1, est le récepteur principalement associé à la signalisation de la chémérine, et a été identifié sur plusieurs types cellulaires (tels que cellules endothéliales et musculaires lisses vasculaires, cellules inflammatoires) jouant des rôles-clés dans la pathogénèse de l’hypertension artérielle pulmonaire. Le but du présent travail était d’évaluer les effets de la chémérine sur la circulation pulmonaire, ainsi que dans le développement de l'hypertension pulmonaire.Nous avons d’abord étudié les effets de la chémérine sur la réactivité artérielle pulmonaire ex vivo et sur les mécanismes impliqués dans le remodelage artériel pulmonaire, plus particulièrement la prolifération, l’apoptose et la migration des cellules musculaires lisses artérielles pulmonaires in vitro. Ces mécanismes jouent des rôles centraux dans la pathogenèse de l'hypertension artérielle pulmonaire. La réponse des artères pulmonaires a été comparée à celle de l’aorte thoracique. L'expression de la chémérine et de ses 3 récepteurs, évaluée par real-time quantitative polymerase chain reaction (RTq-PCR), a été mis en évidence au sein de l'artère pulmonaire et de l'aorte thoracique, ainsi que dans des cultures primaires de cellules musculaires lisses artérielles pulmonaires isolées à partir de rats Wistar. L’expression de CMKLR1 était plus élevée par rapport à celles de CCRL2 et GPR1 et le CMKLR1 était exprimé en plus grande quantité dans l’artère pulmonaire que dans l’aorte thoracique. La chémérine et le CMKLR1 étaient exprimés par les cellules présentes dans les 3 couches de l'artère pulmonaire et de l'aorte thoracique (à savoir dans l’intima, la media et l’adventice), ainsi que dans le parenchyme pulmonaire. Nous avons ensuite étudié ex vivo la vasoréactivité des artères pulmonaire et thoracique (pour lesquelles l’endothélium avait été conservé ou éliminé) isolées à partir de rats Wistar à la chémérine seule ou en association avec un autre agent vasoconstricteur, incluant la phényléphrine, la sérotonine et l'endothéline-1. La chémérine augmentait le tonus vasculaire des artères pulmonaires sans endothélium et potentialisait la vasoconstriction induite par la phényléphrine, la sérotonine et l'endothéline-1 dans les deux types d’artères, effet renforcé en l’absence d'endothélium. Dans les artères avec endothélium, le prétraitement à la chémérine diminuait la vasorelaxation induite par l’acétylcholine, alors qu'elle n'avait pas d’effets sur la vasorelaxation induite par le nitroprussiate de sodium (SNP), un donneur d’oxyde nitrique (NO). En présence du NG-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME), un inhibiteur de l’enzyme impliquée dans la synthèse du NO (NO- synthase, NOS), une vasorelaxation persistait dans les artères prétraitées à la chémérine. Le traitement par la chémérine ou par l’inhibiteur de la guanylate cyclase soluble (ODQ : 1H- [1,2,4]oxadiazolo-[4, 3-a]quinoxalin-1-one) seuls, diminuait partiellement la vasorelaxation induite par l'acétylcholine dans l'artère pulmonaire et l'aorte thoracique, alors que l'incubation combinée de la chémérine et de l'ODQ l'abollissait totalement. Le traitement avec l'apocynine, un inhibiteur de la production des espèces oxygénées radicalaires (ROS), inversait, en partie ou totalement respectivement, les effets de la chémérine. Dans les deux types d’artères, la production de NO induite par l'acétylcholine, ainsi que l'expression des synthases du NO (NOS endothéliale et inductible), étaient réduites par la chémérine. Dans les cultures primaires de cellules musculaires lisses d’artère pulmonaire et d’aorte thoracique de rat, nous avons évalué les effets de la chémérine seule ou en association avec l'endothéline-1, sur la prolifération, la migration et la résistance à l'apoptose. La chémérine associée à l'endothéline-1 augmentait la prolifération, évaluée par l'incorporation de BrdU (5-bromo-2’-deoxyuridine), alors la chémérine ou à l'endothéline-1 seules n’avait pas d’effets. La chémérine induisait la migration des cellules musculaires lisses d’artère pulmonaire et d’aorte thoracique. Cet effet était exacerbé par l'endothéline-1. La chémérine réduisait, de manière concentration-dépendante, l’apoptose induite par la staurosporine et évaluée par cytométrie de flux après double marquage des cellules à l’annexine V et à l’iodure de propidium. Le rapport pro-apoptotique Bax/Bcl2 était également diminué. Dans les cellules musculaires lisses artèrielles pulmonaires, l'endothéline- 1 augmentait l'expression de CMKLR1, CCRL2 et GPR1, alors que ces expressions n'étaient pas modifiées dans les cellules musculaires lisses d’aorte thoracique. En revanche, la chémérine n'induisait aucune modification de l'expression des récepteurs de l'endothéline A et B (ETA et ETB) et ne modifiait pas l'expression de l'interleukine(IL)-6 et de son récepteur IL-6R et de l’IL-1β, alors que l’expression du TNF-α (tumor necrosis factor-alpha) était augmentée par le traitement par la chémérine (10-7 mol/L) dans cellules musculaires lisses d’artère pulmonaire.Ensuite, des mesures invasives, par cathétérisme cardiaque droit, ont été réalisées chez des souris transgéniques déficientes en CMKLR1 (CMLKR1−/−) et des souris wildtype (WT; CMKLR1+/+) en normoxie et après une exposition chronique à l’hypoxie (10% d’oxygène) pendant 3 semaines, afin d’évaluer l'implication du CMKLR1 dans la physio(patho)logie de la circulation pulmonaire. Les résultats préliminaires montraient que les souris CMKLR1−/− présentaient, en normoxie, une élévation de la pression systolique du ventricule droit et de l’indice de Fulton [poids du ventricule droit/ poids des ventricule gauche + septum interventriculaire] suggérant une hypertension pulmonaire et une hypertrophie ventriculaire droite. Les poids des poumons et du coeur étaient diminués chez les souris CMKLR1−/−. L'exposition chronique à l'hypoxie augmentait la pression systolique du ventricule droit et l'indice de Fulton de manière similaire chez les souris CMKLR1−/− et WT.En conclusion, la chémérine potentialise la vasoconstriction induite par des agents vasoconstricteurs, tels que l’endothéline-1 et la sérotonine, et réduit la vasodilatation induite par l'acétylcholine dans l’artère pulmonaire, via notamment le NO et le stress oxydatif. La chémérine associée à l’endothéline-1, un médiateur-clé de la pathogenèse des maladies hypertensives pulmonaires, induit la prolifération et la migration, et augmente la résistance à l'apoptose des cellules musculaires lisses artérielles pulmonaires de rat. Ces résultats suggèrent que la chémérine influence l'homéostasie de la circulation pulmonaire et pourrait renforcer les actions de médiateurs impliqués dans la pathogenèse de l'hypertension pulmonaire, comme l'endothéline-1 et la sérotonine, tant au niveau de la contraction que du remodelage artériel pulmonaire. Les souris déficientes en CMKLR1 présentent une légère hypertension pulmonaire, associée à une hypertrophie du ventricule droit en normoxie. Ce phénotype n’est pas agravé par une exposition chronique à l’hypoxie. Ces résultats préliminaires in vivo doivent être complétés pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents.Chemerin has been identified as a vasoactive adipokine implicated in systemic pressure regulation. Chemerin has also been shown to increase proliferation and migration of systemic vascular smooth muscle cells. Chemokine-like receptor 1 (CMKLR1), the major known signaling receptor of chemerin, is present on different cell types such as vascular endothelial and smooth muscle cells, immune and inflammatory cells, all of these cells playing crucial roles in the pathogenesis of pulmonary arterial hypertension. These observations led us to suggest that chemerin could play a role in pulmonary circulation homeostasis and that alterations of this signaling pathway could participate to the development of pulmonary hypertension.In the first part of the present research project, we studied the effects of chemerin on pulmonary circulation, evaluating its impact on pulmonary artery reactivity ex vivo and on pulmonary artery smooth muscle cell proliferation, apoptosis and migration in vitro. These mechanisms have all been incriminated in the pathophysiological development of pulmonary arterial hypertension. Pulmonary circulation (pulmonary artery) was compared to systemic circulation (thoracic aorta). Expression of chemerin and its three receptors [CMKLR1, G protein-coupled receptor 1 (GPR1) and C-C chemokine receptor-like 2 (CCRL2)], evaluated by real-time quantitative polymerase chain reaction (RTq-PCR), were identified in pulmonary artery and thoracic aorta, and in cultured pulmonary artery smooth muscle cells from Wistar rats, with higher expression of CMKLR1 compared to CCRL2 and GPR1 and higher expression of CMKLR1 in pulmonary artery than in thoracic aorta. Chemerin and CMKLR1 expressions were localized (by immunohistochemistry) in the 3 layers of pulmonary artery and thoracic aorta, as well as in lung parenchyma. Thereafter, we studied ex vivo vasoreactivity in rat endothelium-denuded and -intact arteries to chemerin alone or in association with a vasoconstrictor, including phenylephrine serotonin and endothelin-1. Chemerin increased vascular tone in endothelium-denuded pulmonary artery and potentiated phenylephrine-, endothelin-1- and serotonin-induced vasoconstriction in both pulmonary artery and thoracic aorta, which was further enhanced by endothelium removal. In endothelium-intact arteries, chemerin pretreatment decreased acetylcholine-induced vasorelaxation, while it did not affect relaxation induced by sodium nitroprusside (SNP), a nitric oxide (NO) donor. In presence of a the NO-synthase inhibitor (NG-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride: L-NAME), there remained a vasorelaxation in chemerin-pre-treated arteries, suggesting that chemerin could potentiate another vasodilating pathway. Treatment with chemerin or a soluble guanylate cyclase inhibitor (1H-[1,2,4]oxadiazolo-[4, 3-a]quinoxalin-1-one: ODQ) alone partly decreased acetylcholine-induced vasorelaxation in pulmonary artery and thoracic aorta, while combined chemerin and ODQ incubation abolished it. Treatment with apocynin, a ROS production inhibitor, partly or totally reversed chemerin effects. In both types of arteries, acetylcholine- induced NO production, as well as endothelial NO synthase (eNOS) and inducible NO synthase (iNOS) gene expression, were reduced by chemerin. In primary cultured smooth muscle cells isolated from rat pulmonary arteries and thoracic aorta by the explant technique, we evaluated the effects of chemerin alone or in association with endothelin-1, on proliferation, migration and resistance to apoptosis. Chemerin added to endothelin-1 increased proliferation, assessed by 5-bromo-2’-deoxyuridine (BrdU) incorporation, while chemerin or endothelin-1 alone did not. This effect was less pronounced in thoracic aorta smooth muscle cells. Migration assessed by the Transwell migration assay, showed that chemerin induced migration of rat pulmonary artery and thoracic aorta smooth muscle cells. This effect was exacerbated in presence of endothelin-1 and more pronounced in thoracic aorta smooth muscle cells. In both cell types, chemerin concentration-dependently reduced staurosporine-induced apoptosis, assessed, by flow cytometry, in annexinV and propidium iodure-stained cells. Pro-apoptotic Bcl2 associated X (Bax)-to-Bcl2 apoptosis regulator (Bcl2) ratio was accordingly decreased. In pulmonary artery smooth muscle cells, endothelin-1 treatment increased relative gene expression of CMKLR1, CCRL2 and GPR1, while these expressions were not altered in thoracic aorta smooth mucle cells. In contrast, chemerin did not alter expression of endothelin receptors A and B (ETA and ETB) and chemerin did not alter gene expression of interleukin-6 (IL-6), its receptor IL-6R and interleukin-1beta (IL-1β) but tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) was increased with 10-7 mol/L chemerin in pulmonary artery smooth muscle cells.In the second part of the project, we studied the pulmonary circulation in transgenic CMKLR1-knockout mice (CMLKR1−/−) and challenged it by chronic hypoxia exposure (FiO2 of 10%) during 3 weeks to asses the implication of chemerin/CMKLR1 signaling in the development of pulmonary hypertension. This part of the project is still ongoing. Preliminary results showed that CMKLR1−/− mice presented, in normoxia, higher right ventricular systolic pressure, increased Fulton index [assessed by the ratio of the weights of the right ventricle to the (left ventricle + interventricular septum) weight] showing right ventricular hypertrophy, together with lower lung and heart weights. Chronic hypoxia exposure increased right ventricular systolic pressure and Fulton index similarly in both transgenic and WT mice.In conclusion, chemerin potentiated vascular responses to vasoconstrictors (endothelin- 1 and serotonin) and impaired acetylcholine-induced vasodilatation in pulmonary artery, by mechanisms involving at least partly NO signaling and oxidative stress. Chemerin, together with a key mediator involved in the pathogenesis of pulmonary hypertensive diseases, endothelin-1, stimulated proliferation and migration, and increased resistance to apoptosis in rat primary cultured pulmonary artery smooth muscle cells. Altogether, these results suggest that chemerin influences rat pulmonary circulation homeostasis, and could reinforce the actions of mediators implicated in the pathogenesis of pulmonary hypertension, such as endothelin-1 and serotonin, in pulmonary artery contraction and remodeling. Knocking-out CMKLR1 signaling in mice was associated with mild pulmonary hypertension, in animals presenting lower lung and heart weights. These preliminary in vivo results have to be completed to understand better underlying mechanisms. |
