Développement et évaluation de formulations pour inhalation à base d'anticancéreux dans le cadre du traitement des tumeurs pulmonaires

Pour apporter des réponses aux principales problématiques rencontrées avec l’administration systémique de la chimiothérapie conventionnelle qui est principalement constituée d’agents pro-apoptotiques, nous avons développé des formulations à base d’agents antinéoplasiques aux propriétés anticancéreuses non pro-apoptotiques qui sont destinées à être administrées de manière localisée par la voie inhalée. Il faut savoir que l’inhalation est la voie d’administration préférentielle des principales affections respiratoires telles que l’asthme, la bronchopneumonie chronique obstructive et la mucoviscidose.

La première partie de ce travail a consisté à produire et à évaluer des formulations à base de témozolomide destinées à être administrées chez la souris porteuse de pseudo-métastases pulmonaires (issues d’un mélanome expérimental, le modèle B16F10), soit via la voie intraveineuse (iv) conventionnelle soit via la voie inhalée à l’aide d’un dispositif endotrachéal approprié. La suspension pour inhalation a été produite à l’aide de technique de réduction de taille et a été stabilisée à l’aide de phospholipides compatibles avec la voie pulmonaire. L’activité anticancéreuse in vitro a été vérifiée pour le témozolomide formulé sous forme de suspension pour inhalation et de solution intraveineuse par rapport à du témozolomide non formulé sur des lignées de cellules cancéreuses de cancer humain NSCLC A549, de glioblastome humain T98G et de mélanome murin B16F10. Cette dernière lignée a été utilisée pour générer les pseudo-métastases pulmonaires chez la souris en injectant les cellules de mélanomes dans la voie systémique via la veine caudale. La reproductibilité de la dose et de l’aérosol générés à partir de la suspension pour inhalation à l’aide du dispositif d’administration endotrachéal et la déposition des gouttelettes dans les poumons de la souris ont pu être respectivement évaluées avec précision par une méthode de quantification du témozolomide qui a été validée par nos soins, par des techniques de diffraction laser et par des techniques de microscopie à fluorescence et d’analyse d’images histologiques. Enfin, l’activité antitumorale in vivo et la tolérance des traitements conventionnels ou localisés ont été vérifiées chez la souris porteuse de ces pseudo-métastases pulmonaires B16F10. Les résultats ont montré que le dispositif endotrachéal utilisé permettait de produire des doses et des aérosols reproductibles et de déposer les gouttelettes d’aérosol profondément dans les poumons des souris. De plus, lors de l’étude in vivo, les traitements administrés étaient bien tolérés et la dose de témozolomide administré sous forme de suspension pour inhalation à l’aide du dispositif endotrachéal avait permis d’obtenir une efficacité antitumorale similaire à une dose similaire de témozolomide administrée par la voie iv conventionnelle. De plus, 11% (3/27) de souris « long-survivantes » avaient été observées avec le groupe traité par inhalation trois fois par semaine pendant trois semaines consécutives et les poumons de ces long-survivants avaient présenté une éradication quasi complète des tumeurs pulmonaires. Ce phénomène n’avait pas été observé dans les groupes de souris traitées de manière conventionnelle.

Ensuite, la seconde partie de notre travail a consisté en l’élaboration du témozolomide sous forme de poudres sèches pour inhalation destinées à être délivrées à l’aide d’un dispositif à poudre sèche à usage humain. Pour ce faire, nous avons développé les poudres sèches pour inhalation à l’aide de techniques de réduction de taille pour microniser la poudre de départ et d’atomisation pour évaporer le solvant et élaborer un enrobage autour des particules micronisées. La nature de l’enrobage était soit hydrophile soit lipophile. Ensuite les caractéristiques physicochimiques telles que les propriétés thermiques, les propriétés cristallines, la distribution de taille particulaire et la morphologie des formulations de poudre sèche pour inhalation ont été évalués à l’aide de techniques appropriées telles que la calorimétrie différentielle à balayage, la diffraction des rayons X sur poudre, la diffraction de la lumière laser et la microscopie électronique à balayage. Les profils de déposition pulmonaire et de dissolution ont été respectivement déterminés in vitro à l’aide de l’essai de la pharmacopée européenne utilisant l’impacteur à cascade multi-étages et d’un test de dissolution adapté aux formes pulmonaires. Les quatre formulations élaborées présentaient des caractéristiques physicochimiques intéressantes pour la stabilité à long-terme de la substance active et des formulations. De plus, deux formulations de poudre sèche pour inhalation (les formulations F1 et F2) présentaient des propriétés aérodynamiques tout à fait attrayantes avec une fraction minimale de poudre déposée au niveau du tractus respiratoire supérieure et une fraction maximale de poudre déposée au niveau du tractus respiratoire inférieur où se localisent les tumeurs pulmonaires. De plus, l’ensemble des formulations ont montré que la fraction sélectionnée des particules fines des poudres sèches pour inhalation libérait 75% du témozolomide dans le liquide simulant le fluide pulmonaire endéans les dix premières minutes du test de dissolution in vitro adapté aux formes pulmonaires.

Enfin, nous avons comparé l’efficacité et la tolérance in vivo d’une de nos formulations de poudre sèche de témozolomide pour inhalation administrée soit sous forme de suspension, soit sous forme de poudre sèche, à l’aide du dispositif endotrachéal approprié chez la souris porteuse de pseudo-métastases pulmonaires. L’uniformité de la dose délivrée par les différents dispositifs a été évaluée à l’aide d’une technique quantitative validée. Les résultats de cette étude ont montré qu’en administrant une formulation de poudre sèche sous forme d’un mélange de poudres plutôt que sous forme d’une suspension liquide, les doses en témozolomide à administrer pour obtenir une efficacité comparable était au moins deux fois moins élevées. Cependant, le dispositif endotrachéal pour les formulations de poudre présentait plus de variabilité au niveau de la dose délivrée que le dispositif endotrachéal pour les formulations liquides ce qui induit une variabilité dans les doses délivrées. Pour clôturer ce travail, nous avons appliqué certaines techniques que nous avons développées pour le témozolomide à une nouvelle molécule de synthèse, le trivanillate polyphénolique 13c, qui montre des propriétés anticancéreuses intéressantes dans le cadre des tumeurs pulmonaires. En effet, une méthode quantitative a été développée et a été validée. Une étude de pré-formulation et des essais de formulation pour produire une suspension, des complexes d’inclusion et des microparticules lipidiques ont été entrepris avec de relativement bons résultats pour les complexes d’inclusion élaborés avec des gamma cyclodextrines qui permettaient d’augmenter la solubilité dans l’eau de la molécule de 13c d’un facteur d’au moins 1,5×106. De plus, les particules de 13c montraient la particularité de se solubiliser dans un mélange dichlorométhane/éthanol (1 :1 v/v) ce qui nous a permis d’élaborer des microparticules lipidiques pour lesquelles les propriétés de mouillage devront être améliorées dans l’avenir./

Primary lung tumors, mainly represented by non-small-cell lung cancers (cancers NSCLC), or secondary lung tumors (metastasis) cause the death of hundred thousand human beings worldwide. Despite the therapeutic modalities used, the five-year survival rate reaches only 15%. Nowadays, it is known that cancers NSCLC and metastasis are intrinsically resistant to apoptosis.

To overcome the main problems occurring with the systemic delivery of conventional chemotherapy which are mainly constituted of non-specific and non selective pro-apoptotic agents, we have developed some formulations based on non pro-apoptotic antineoplasic drugs which are designed to be delivered by a localized administration, the inhalation. Indeed, inhalation is the preferential route to treat the main pulmonary affections such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease or cystic fibrosis.

The first part of this work consisted to produce and evaluate temozolomide-based formulations designed to be delivered to mice bearing pulmonary pseudo-metastases (using a experimental melanoma, the B16F10 model), either by the conventional intravenous (iv) route or by inhalation using an endotracheal device appropriate to mice. The suspension for inhalation was produced by means of a high pressure homogenizing technique using phospholipids compatible with the lungs to stabilize the suspension. The in vitro anticancer activity was evaluated for both temozolomide-based formulations in comparison with non-formulated temzolomide on three cancer cell lines, a human NSCLC cancer cells (A549), a human glioblastoma cancer cells (T98G) as positive control and a murine melanoma cancer cells (B16F10). The latter was used to generate lung tumors in mice by injecting the melanoma cells by iv. Reproducibility of delivered dose and generated aerosol by the endotracheal device from the suspension for inhalation and the deposition of droplets in the mouse lungs were precisely evaluated by means of a validated HPLC determination method, a laser diffraction technique and fluorescent microscopy and histological image analysis, respectively. Then, the tolerance and the antitumor efficacy of iv or inhaled temozolomide-based treatments were evaluated on mice bearing pulmonary pseudo-metastases B16F10. The results showed that endotracheal device produced reproducible doses and aerosols and that the aerosol droplets were deposited deeply in the mouse lungs. Moreover, the temozolomide-based treatments were well tolerated in terms of weight evolution and the inhaled based-temozolomide treatments were able to get the same antitumor efficacy in terms of median survival rate as the conventional iv based-temozolomide treatments delivered at a same frequency. Moreover with the group treated by inhalation three times a week during three consecutive weeks, 11% (3/27) mice survived with an almost complete eradication of lung tumors which was not observed with the groups treated by conventional route.

Then, the second part of our work consisted to produce temozolomide-based dry powders for inhalation able to be delivered with a dry powder inhaler for human use. We developed the dry powders for inhalation using a high-pressure homogenizing technique to micronize temozolomide particles and then spray-drying technique to coat temozolomide microparticles. The coating was either hydrophilic or lipophilic. Then, the physicochemical characteristics such as thermal or crystalline properties, the particle size distribution and the particle morphology were evaluated for the four dry powders for inhalation by means of differential scanning calorimetry, x-ray powder diffraction, laser light scattering and scanning electron microscopy, respectively. The in vitro pulmonary deposition and dissolution were respectively determined by European pharmacopeia assay for the aerodynamic assessment of fine particles using a multi-stage liquid impinger and by dissolution test optimized for inhaler products. The four formulations produced presented physicochemical properties promoting long-term stability of temozolomide and formulations.Moreover, two of them (dry powder without coating or with a thin lipid coating) showed attractive aerodynamic properties with a minimal fraction of powder deposited in the oropharyngeal and tracheal zones and maximal fraction deposited in the lungs (almost 50% of the nominal dose) where the lung tumors are localized. Moreover, fine particle fraction of all formulations showed a fast release and dissolution of temozolomide with more than 75% of temozolmide dissolved within 10 minutes in the simulated lung fluid during the in vitro dissolution test optimized for dry powders for inhalation.

Then, we compared the in vivo antitumor efficacy and tolerance of one of dry powders for inhalation on mice bearing pulmonary pseudo-metastases B16F10. The dry powder for inhalation was administered either by dispersing it as a extemporaneous suspension able to be delivered by the endotracheal device for liquid forms or by mixing it with a spray-dried diluent able to be delivered by the endotracheal device for dry powders. The uniformity of delivered dose by the different endotracheal device was evaluated by a validated quantitative method. The results showed that the delivery of the powder mixture presented the same antitumor efficacy as the extemporaneous suspension but for a half dose of temozolomide. However, the endotracheal device for dry powders presented a higher variability of delivered dose than the endotracheal device for liquid forms.

Finally, we apply the pulmonary application on a polyphenol developed in the Faculty of Pharmacy, the molecule 13c, that showed very interesting in vitro anticancer properties against lung tumors. So, a quantitative method was developed and was validated. A preformulation studie was performed and formulation developements are on-going.