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Fluorescent protein-based biosensors to shed light on hepatic glycolysis and metabolic regulation

par Perez Chavez, Israel
Président du jury Loris, Remy
Promoteur Gurzov, Esteban Nicolas ;Messens, Joris
Co-Promoteur Ezeriņa, Daria
Publication Non publié, 2026-02-04

Thèse de doctorat

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Résumé :	The liver performs essential metabolic functions, and disruptions caused by viruses, alcohol, or fat accumulation can lead to severe diseases, including fibrosis, cirrhosis, and liver cancer. This thesis explores the potential of genetically encoded fluorescent biosensors to uncover metabolic mechanisms underlying such conditions, with a focus on glycolysis, a central driver of metabolic remodeling in the liver. Chapter 1 provides an overview of available biosensors for monitoring liver-related metabolic pathways and the types of questions they can address. Subsequent chapters examine two glycolytic biosensors that detect distinct intermediates: glucose 6-phosphate (BUGI) and fructose 1,6-bisphosphate (HYlight), which reflect the rate-limiting step of glycolysis. I designed and built BUGI, but it showed low analyte affinity and poor performance in mammalian cells. Meanwhile, HYlight, released during the development of BUGI, displayed superior selectivity and functionality. After comparing both probes (Chapter 2), HYlight was selected, although key information on its properties remained obscure. Chapter 3 fills these gaps and introduces a method to convert HYlight fluorescence into absolute fructose 1,6-bisphosphate concentrations in single cells, revealing micromolar levels rather than the previously assumed millimolar range. In Chapter 4, I apply HYlight to investigate the roles of genes (PTPRK, PTPRF, TXNIP) implicated in modulating glycolytic flux in various pathophysiological contexts, underscoring the value of HYlight for studying liver metabolism. The thesis concludes by discussing current barriers to broader biosensor adoption, future biosensor development, and the prospects of HYlight as a tool for glycolytic assessment. Overall, this work highlights the significant promise of fluorescent biosensors as reliable instruments for metabolic research and for advancing understanding of liver disease.
	Le foie assure de nombreuses fonctions physiologiques essentielles, et des altérations de son métabolisme — liées notamment à des infections virales, à la consommation d’alcool ou à l’accumulation de lipides — peuvent entraîner des pathologies sévères telles que la fibrose, la cirrhose et le cancer du foie. Cette thèse explore l’utilisation des biocapteurs fluorescents codés génétiquement pour étudier les mécanismes métaboliques sous-jacents à ces pathologies. Une attention particulière est portée à la glycolyse, un processus métabolique clél impliqué dans le remodelage du métabolisme hépatique. Le Chapitre 1 présente un état de l’art des biocapteurs existants pour l’analyse des voies métaboliques hépatiques et expose les principales questions biologiques qu’ils permettent d’aborder. Les chapitres suivants se concentrent sur deux biocapteurs glycolytiques ciblant des métabolites distincts : le glucose 6-phosphate (BUGI) et le fructose 1,6-bisphosphate (HYlight), ce dernier étant produit lors de l’étape limitante de la glycolyse. BUGI, que j’ai développé, présente une faible affinité et des performances limitées dans les lignées cellulaires testées. HYlight, publié au cours du développement de BUGI, s’avère nettement plus sélectif et performant. Après une comparaison approfondie des deux sondes (Chapitre 2), HYlight a été sélectionné, bien que certaines de ses caractéristiques restent à définir. Le Chapitre 3 vise à combler ces lacunes et décrit une méthode permettant de convertir la fluorescence de HYlight en une concentration absolue de fructose 1,6-bisphosphate. Je montre également que la concentration intracellulaire de ce métabolite est de l’ordre du micromolaire, et non du millimolaire comme estimé précédemment. Dans le Chapitre 4, HYlight est utilisé pour évaluer l’effet de différents gènes (PTPRK, PTPRF, TXNIP) sur le flux glycolytique dans divers contextes physiopathologiques, illustrant la pertinence de ce biocapteur pour l’étude du métabolisme hépatique. Enfin, le dernier chapitre discute des limitations actuelles des biocapteurs fluorescents, des critères essentiels pour le développement de nouvelles sondes, et souligne l’intérêt particulier de HYlight pour l’étude du flux glycolytique. En conclusion, ce travail met en évidence le potentiel des biocapteurs fluorescents pour l’étude du métabolisme et, plus spécifiquement, pour approfondir la compréhension des mécanismes impliqués dans les maladies hépatiques.
	De lever vervult talrijke essentiële functies, en verstoringen in zijn metabolisme — veroorzaakt door virussen, alcohol of vetstapeling — kunnen leiden tot ernstige aandoeningen zoals fibrose, cirrose en leverkanker. Dit proefschrift onderzoekt hoe genetisch gecodeerde fluorescerende biosensoren kunnen bijdragen aan het blootleggen van de metabole mechanismen achter deze aandoeningen, met specifiek aandacht voor de glycolyse als drijvende kracht van metabole veranderingen in de lever. In hoofdstuk 1 worden de beschikbare biosensoren voor het volgen van levermetabole routes voorgesteld en de onderzoeksvragen die daarmee kunnen worden aangepakt. In de daaropvolgende hoofdstukken bespreek ik twee glycolytische biosensoren die verschillende metabolieten meten: glucose-6-fosfaat (BUGI) en fructose 1,6-bisfosfaat (HYlight), het snelheid-bepalende knooppunt van de glycolyse. Ik ontwierp en ontwikkelde BUGI, maar deze sensor bleek uiteindelijk een lage affiniteit en beperkte functionaliteit in zoogdiercellen te hebben. HYlight daarentegen - gepubliceerd terwijl BUGI nog in ontwikkeling was - bleek selectiever en presteerde duidelijk beter. Op basis van de vergelijking van beide sensoren (Hoofdstuk 2) werd daarom voor HYlight gekozen, ondanks het ontbreken van cruciale informatie over zijn kenmerken. Hoofdstuk 3 vult deze ontbrekende informatie aan en introduceert een methode om HYlight-fluorescentie te vertalen naar absolute fructose 1,6-bisfosfaatconcentraties in individuele cellen. Ik toon aan dat deze niveaus micromolair zijn, aanzienlijk lager dan de eerder gerapporteerde millimolaire waarden. In Hoofdstuk 4 gebruik ik HYlight om de rol te onderzoeken van genen (PTPRK, PTPRF, TXNIP) waarvan wordt vermoed dat zij de glycolytische flux beïnvloeden in verschillende pathofysiologische situaties, wat het nut van HYlight voor levermetabolismeonderzoek onderstreept. In het afsluitende hoofdstuk worden de belangrijkste barrières voor de brede toepassing van fluorescerende biosensoren in metabolisch onderzoek besproken, toekomstperspectieven voor nieuwe sensoren en verdere ontwikkelingen in het vakgebied, inclusief de toekomstige rol van HYlight als glycolysemarker. Daarmee toont dit werk aan dat fluorescerende biosensoren aanzienlijke potentie hebben als robuuste onderzoeksinstrumenten die in de toekomst kunnen bijdragen aan het bestrijden van leverziekten.