par Parsajoo, Cobra
Président du jury Dufrasne, François
Promoteur Van Antwerpen, Pierre
Co-Promoteur Delporte, Cédric
Publication Non publié, 2025-12-17
Thèse de doctorat
Résumé : Les plateformes analytiques à base d’enzymes sont de plus en plus utilisées en recherche biochimique, en diagnostic clinique et dans la découverte de médicaments, en raison de leur haute efficacité catalytique et de leur spécificité de substrat. Cependant, l’utilisation d’enzymes libres dans des systèmes en flux et à haut débit est souvent limitée par leur faible stabilité, leur faible réutilisabilité et leur sensibilité aux fluctuations de l’environnement. Les réacteurs à enzyme immobilisée (IMER), dans lesquels les enzymes sont fixées sur des supports solides, offrent une alternative robuste qui augmente la longévité enzymatique et facilite l’intégration dans des dispositifs miniaturisés et automatisés. Le choix d’une stratégie d’immobilisation appropriée est particulièrement crucial lorsqu’il s’agit d’enzymes dont le site actif est profondément enfoui ou présente une organisation structurelle complexe.Cette thèse a pour objectif de concevoir, construire et évaluer des systèmes enzymatiques immobilisés pour la détection et l’étude cinétique d’inhibiteurs enzymatiques. Deux enzymes modèles, fonctionnellement et structurellement distinctes, ont été sélectionnées : l’acétylcholinestérase (AChE) et la myéloperoxydase (MPO). Ces enzymes diffèrent fortement par leur structure globale et par l’orientation spatiale de leur site actif. Néanmoins, toutes deux sont des cibles majeures pour le criblage d’inhibiteurs en raison de leur rôle biologique bien établi. L’AChE joue un rôle essentiel dans la terminaison du signal nerveux et constitue une cible fréquente de composés neurotoxiques, tandis que la MPO est une enzyme clé des réponses inflammatoires et du stress oxydatif. Ce travail explore comment l’immobilisation influence leur activité, leur stabilité, leur affinité pour le substrat et leur compatibilité avec des systèmes de détection en flux.L’AChE a été immobilisée de manière covalente sur des électrodes en or au moyen d’une stratégie de couplage glutaraldéhyde–cystéamine. L’enzyme immobilisée a été intégrée dans un capteur électrochimique, et ses performances catalytiques ont été évaluées par des mesures ampérométriques en présence d’acétylthiocholine (ATCh). Les paramètres cinétiques, tels que Km et Vmax (Imax), ont été déterminés afin d’évaluer l’affinité pour le substrat et l’efficacité enzymatique. La stabilité opérationnelle et la stabilité au stockage ont également été étudiées sur plusieurs jours d’utilisation répétée.La MPO a été immobilisée sur différents supports solides en utilisant plusieurs approches : adsorption physique, emprisonnement dans la chitine/chitosane et liaison covalente via le glutaraldéhyde, des surfaces activées au CNBr (bromure de cyanogène) et des groupes époxy. Des tests d’activité ont été réalisés en mode hors ligne et en mode en ligne. La détection hors ligne reposait sur une quantification colorimétrique de la taurine chloramine produite par l’oxydation du peroxyde d’hydrogène catalysée par la MPO. Les configurations en ligne utilisaient l’analyse en flux par injection (FIA) et la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse quadripolaire temps de vol (LC–QTOF-MS) pour suivre l’activité de la MPO et la cinétique d’inhibition en flux continu.L’AChE immobilisée a montré une bonne stabilité opérationnelle, conservant environ 75 % de son activité initiale après 25 jours. La valeur apparente de Km était comparable à celles rapportées dans la littérature, ce qui indique que l’immobilisation a permis de maintenir une forte affinité pour le substrat, probablement grâce à une orientation et un empaquetage favorable de la couche enzymatique à la surface de l’électrode.La MPO immobilisée dans une configuration en tube a présenté une stabilité et une activité modérées, en particulier lorsque le couplage covalent était réalisé par la chimie CNBr. Lineweaver–Burk a donné des valeurs de Km de 31 µM (forme libre) et 46 µM (immobilisée), avec des valeurs de Vmax correspondantes de 316 et 463 µM/min. Ces résultats suggèrent que l’immobilisation a légèrement affecté la diffusion et l’affinité pour le substrat, tout en préservant la fonctionnalité catalytique. Des résultats de stabilité comparables ont également été obtenus avec d’autres supports, notamment des disques monolithiques, des colonnes monolithiques et des colonnes remplies de silice activée au CNBr.L’analyse comparative a mis en évidence que l’AChE est plus adaptée à une intégration dans des plateformes de détection en ligne, en raison de sa configuration structurale et de l’accessibilité de son site actif. À l’inverse, le site actif profondément enfoui de la MPO a posé des défis pour l’accès au substrat et aux inhibiteurs après immobilisation, limitant son applicabilité dans des systèmes en flux continu. Les deux enzymes ont néanmoins fourni des signaux reproductibles et une bonne sensibilité aux inhibiteurs, ce qui en fait des candidates prometteuses pour le criblage d’inhibiteurs et l’enzymologie mécanistique, en particulier lorsqu’elles sont couplées à des techniques de détection modernes.Cette thèse démontre la faisabilité de construire des systèmes IMER robustes pour différentes classes d’enzymes et souligne l’importance de prendre en compte la structure enzymatique lors du choix des stratégies d’immobilisation. L’AChE s’est révélée être une excellente candidate pour des essais inhibiteurs électrochimiques et en flux, tandis que la MPO a nécessité une optimisation plus poussée pour préserver son activité sous forme immobilisée. Malgré certaines limites, la MPO immobilisée a fourni des informations analytiques utiles en mode hors ligne.Les travaux futurs devraient viser à élargir le panel d’enzymes immobilisées via la co-immobilisation, l’utilisation de tags d’affinité pour contrôler l’orientation et l’intégration dans des plateformes microfluidiques de type lab-on-chip. L’approche développée ici peut être étendue à d’autres peroxydases, hydrolases et oxydoréductases pour des essais multiplexés, des diagnostics en temps réel et des dispositifs de type point-of-care. Cette étude contribue à l’avancement des sciences analytiques à base d’enzymes et fournit une base pour de futures innovations en chimie bioanalytique et en criblage pharmaceutique.

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