par America, Michelle 
Président du jury Vanhamme, Luc
Promoteur Vanhollebeke, Benoît
Publication Non publié, 2024-11-13
Président du jury Vanhamme, Luc
Promoteur Vanhollebeke, Benoît
Publication Non publié, 2024-11-13
Thèse de doctorat
| Résumé : | Les cellules endothéliales (CE) qui forment la paroi des vaisseaux sanguins du système nerveux central (SNC) présentent des propriétés uniques qui les différencient des autres cellules endothéliales de l’organisme. Ces propriétés, regroupées sous le terme de « barrière hématoencéphalique (BHE) », sont indispensables à la protection du tissu neural et à la maintenance d’un environnement propice à l’activité neuronal. Une seule CE qui fuirait sa fonction pourrait théoriquement compromettre la BHE dans son ensemble. Un développement uniforme des propriétés de barrière à travers tout l’endothélium cérébral semble donc nécessaire pour assurer une neuroprotection adéquate. La voie de signalisation β-caténine dépendante de Wnt7a/b et induite par Gpr124/Reck est essentielle à la vascularisation du SNC et au développement de la BHE. Cette voie de signalisation devrait donc être active dans chaque CE du SNC. Cette thèse de doctorat présente les expériences menées sur le poisson zèbre et en culture cellulaire visant d’une part, à caractériser la transduction du signal spécifique à la voie Wnt7a/b dans les CE et d’autre part, à évaluer l’implication de cette voie dans la maturation uniforme des CE de la BHE au sein du SNC. Tout d’abord, nous avons investigué le rôle mécanique du domaine intracellulaire (DIC) du composant Gpr124 du complexe récepteur Wnt dans la transduction du signal. En comparant ce domaine chez le poisson zèbre, la souris et les orthologues humains, nous avons découvert un mécanisme de signalisation commun impliquant un domaine de liaison PDZ C-terminal hautement conservé (ETTV-motif). Certains récepteurs Frizzled présentent également un motif ETXV et, grâce à la liaison de protéines adaptatrices nouvellement identifiées, Dlg4 ou Magi3, l'interaction entre les récepteurs Reck/Gpr124 liés à Wnt7a/b et les récepteurs Frizzled/Lrp5/6 peut être médiée. Outre ce point commun évolutif, nous avons également identifié des diversifications fonctionnelles chez les orthologues non-mammaliens et mammaliens. La protéine Gpr124 du poisson zèbre peut fonctionner via le recrutement de Dvl sur un motif de liaison Dvl présent au niveau son DIC. Dvl est connu pour lier tous les récepteurs Frizzled avec des forces variables et l'échafaudage de protéines Dvl permet d'assembler le complexe récepteur avec n'importe quel Frizzled. Les protéines Gpr124 de la souris et de l'homme ne possèdent cependant pas de motif de liaison à Dvl et peuvent signaler par des mécanismes indépendants du DIC.Ensuite, nous avons exploré l’implication de la transduction du signal Wnt médiée par Gpr124 - décrite ci-dessus - dans l'acquisition uniforme des propriétés de barrière dans toutes les CE du SNC. Au cours de l'angiogenèse, certaines CE se différencient par rapport aux autres et deviennent des « tip cells ». Ces tip cells sont en contact avec d’autres CE, appelées « stalk cells » ou « pré-stalk cells ». Parmi ces stalk cells, l'une est sélectionnée pour suivre la tip cell qui progresse dans le tissu. Au cours de l'angiogenèse du SNC, les vaisseaux périneuraux sont constitués de CE positives et négatives à l'égard de la signalisation Wnt. Précédemment, il a été démontré que les tip cells qui envahissent le SNC sont invariablement positives pour la voie de signalisation Wnt7a/b activée par l'intermédiaire de Gpr124/Reck. L'expression de Mmp25 induite par Wnt7a/b dans ces cellules est nécessaire au clivage du collagène de type 4 dans la membrane basale qui entoure le SNC, ce qui permet aux tip cells de s'étendre dans le tissu neural. Cette régulation organotypique garantit que seules les tip cells Wnt-positives, compatibles avec l’acquisition des propriétés de barrière, peuvent pénétrer dans le cerveau. L'état de la signalisation Wnt dans les stalk cells n'a cependant pas été correctement documenté. Nous avons observé ici que les tip cells entrent en contact avec des pré-stalk cells positives et négatives pour la voie Wnt dans les vaisseaux périneuraux. Néanmoins, les stalk cells sélectionnées pour suivre les tip cells dans le tissu neural sont presque invariablement positives pour la voie Wnt. Il a été démontré que cette sélection des stalks cells positives pour la voie Wnt dépendait du niveau de VE-cadhérine qui interagit avec Gpr124 dans les jonctions d'adhérence. Gpr124 est impliqué dans le renouvellement de la VE-cadhérine, ce qui entraîne des niveaux inférieurs de VE-cadhérine dans les tip cells et (pré-) stalk cells positives pour la voie Wnt, par rapport aux cellules négatives pour la voie Wnt. Grâce à leurs propriétés adhésives différentielles, les stalk cells Wnt-positives sont préférentiellement sélectionnées pour suivre les tip cells dans le SNC, laissant derrière elles les cellules Wnt-négatives. Il a été démontré que ce renouvellement de la VE-cadhérine induit par Gpr124 se produit indépendamment de l'activité transcriptionnelle dépendante de la voie Wnt7a/b/Gpr124/Reck. Cependant, nous avons découvert que la libération de la β-caténine liée à la VE-cadhérine au niveau des jonctions adhérentes est nécessaire pour assurer l'activation de cette voie. Nous proposons donc un modèle dans lequel le renouvellement de la VE-cadhérine induit par Wnt7a/b/Gpr124/Reck libère la β-caténine de la membrane, activant la transcription de gènes associés à la BHE. Ce renouvellement de la VE-cadhérine entraîne les propriétés adhésives différentielles nécessaires à la sélection des CE Wnt positives compétentes pour la vascularisation du SNC et la formation de la BHE. Cela garantit le développement uniforme de la BHE au sein du SNC et préserve l'homéostasie du cerveau. |
| To safeguard the delicate central nervous system (CNS), intraneural blood vessels acquire unique properties, called the blood-brain barrier (BBB). As a single leaky endothelial cell (EC) could theoretically compromise barrier function as a whole, a uniform development of the BBB amongst CNS ECs seems required to achieve proper neuroprotection. The Wnt7a/b-induced Gpr124/Reck-dependent β-catenin signaling pathway is essential for BBB development, as well as for brain vascularization, and should therefore be active in every CNS EC to achieve proper neuroprotection. In this PhD thesis, we combined zebrafish and cell culture experiments to characterize the Wnt7a/b-specific signal transduction pathway in ECs and evaluate its implication in the uniform BBB maturation of CNS ECs. We first studied the mechanistic role of the intracellular domain (ICD) of Wnt receptor complex component Gpr124, by comparing its importance in zebrafish, mouse, and human orthologs. We found a common signaling mechanism involving the highly conserved C-terminal PDZ binding domain (ETTV-motif). A subset of Frizzled receptors also contains an ETXV motif, and through binding of newly identified adaptor proteins Dlg4 or Magi3, the interaction between Wnt7a/b-bound Reck/Gpr124 receptors and Frizzled/Lrp5/6 receptors can be mediated. Aside from this evolutionary commonality, we identified functional diversifications in non-mammalian and mammalian orthologues. Zebrafish Gpr124 can operate via Dvl recruitment to a Dvl-binding motif of the ICD. As Dvl is known to bind all Frizzled receptors with varying strengths, scaffolding of Dvl therefore assembles the receptor complex with any Frizzled. Mouse and human Gpr124 however lack the Dvl-binding motif and instead can signal through ICD-independent mechanisms.Next, we evaluated whether the above-described Gpr124 signal transduction pathway partakes in ensuring a uniform acquisition of BBB properties in CNS ECs. During angiogenesis, a subpopulation of cells is defined to become tip cells. These tip cells are contacting multiple potential stalk cells (or pre-stalk cells), one of which is selected to follow the cell into the tissue. During CNS angiogenesis, the perineural vessels consist of Wnt-positive and Wnt-negative ECs, however the tip-cells invading the CNS were previously shown to be invariably Wnt-positive through Gpr124/Reck-mediated signaling. Wnt7a/b-induced expression of Mmp25 in these cells is required for cleavage of the Collagen type 4 in the CNS basement membrane, allowing the tip cells to sprout into the brain. This organotypic regulation ensures that only Wnt-positive, and therefore BBB-competent tip cells can enter the brain. The Wnt-signaling status of the stalk cells however had not been properly documented. Here we observed that the tip cells are contacting both Wnt-positive and Wnt-negative pre-stalk cells in the perineural vessels, however the selected stalk cells are almost invariably Wnt-positive. This selection for Wnt-positive trailing stalk cells was shown to rely on the level of VE-cadherin, which is interacting with Gpr124 in the adherens junctions. Gpr124 is involved in the turnover of VE-cadherin, resulting in lower levels of VE-cadherin in the Wnt-positive tip and (pre-)stalk cells, compared to the Wnt-negative cells. Through their differential adhesive properties, the Wnt-positive stalk cells are preferentially selected to follow the tip cells into the CNS, leaving the Wnt-negative cells behind. This Gpr124-induced turnover of VE-cadherin was shown to occur independent of the transcriptional activity of the Wnt7a/b/Gpr124/Reck-dependent pathway, however we further discovered that the release of β-catenin from VE-cadherin at the adherens junctions is required to ensure the activation of this pathway. We therefore propose a model in which the Wnt7a/b/Gpr124/Reck-induced turnover of VE-cadherin releases β-catenin from the membrane, activating the transcription of the BBB-associated genes. This turnover of the VE-cadherin results in the differential adhesive properties required for the selection of BBB competent/Wnt-positive ECs for CNS vascularization, warranting the uniform development of the BBB and safeguarding the homeostasis of the brain. |
