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Contribution to the study of aquaporin-5 trafficking in salivary glands

par D'Agostino, Claudia
Président du jury Maenhaut, Carine
Promoteur Delporte, Christine
Co-Promoteur Flamand, Véronique
Publication Non publié, 2024-04-23

Thèse de doctorat

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Résumé :

Aquaporins (AQPs) are a family of integral membrane proteins essential for facilitating water flow across biological membranes, responding to osmotic gradients. AQPs are essentially regulated by trafficking. Among AQPs, Aquaporin-5 (AQP5) emerges as a particularly important member. Indeed, AQP5 stands out as a key player in water flow, essential for physiological functions in several essential tissues, notably in exocrine glands where it plays a fundamental role in saliva secretion. Moreover, the AQP5’s effects extend beyond its water channel function, as evidenced by its role in various biological processes through protein-protein interactions and activation of signaling pathways. AQP5 deregulation is implicated in several diseases, including primary Sjögren’s syndrome (pSS), an autoimmune disease characterized by salivary and lacrimal gland inflammatory infiltrations, often resulting in glandular dysfunction. Consequently, there is a need to unravel the molecular mechanisms governing AQP5 function, trafficking, and interactions with other cellular components. The research carried out within the frame of this doctoral thesis focuses on the intricate regulatory mechanisms of AQP5 trafficking, emphasizing the role of the C-terminal tail and the involvement of prolactin-inducible protein (PIP) as a key interacting partner in AQP5 trafficking. To assess AQP5 localization to the plasma membrane, an innovative 2D-custom cell model was developed and validated in a salivary gland acinar cell line using SNAP-tag and fluorescent microscopy coupled to an automated in-house algorithm-based methodology. Using C-terminal truncated constructs, we revealed specific responses to intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and calcium increase, highlighting the implication of specific sites within the C-terminal tail for AQP5 trafficking. Furthermore, investigation of the interplay between AQP5 and PIP revealed PIP's role in promoting AQP5 translocation to the plasma membrane, while also assessing the effects of calcium- and cAMP-dependent signaling pathways on AQP5 sub-cellular localization. Our research works also identified CLIP2, a cytoplasmic linker protein, as a novel interacting partner of AQP5. Co-immunoprecipitation coupled with mass spectrometry and microscale thermophoresis confirmed the direct interaction between AQP5 and CLIP2. Structural modeling of the AQP5-CLIP2 interaction revealed similarities to other CAP-Gly domain complexes, highlighting the complexity of AQP5 regulation. Functional exploration revealed that CLIP2 significantly influences AQP5 trafficking, potentially forming multiprotein complexes with other AQP5 protein partners in salivary glands. In pSS, the observed alterations in AQP5-CLIP2 interactions and the presence of autoantibodies against these proteins underscore their involvement in pSS pathology and offer potential therapeutic targets for future therapeutic interventions.

Les aquaporines (AQPs) sont une famille de protéines transmembranaires essentielles pour assurer le flux d'eau à travers les membranes biologiques, en réponse aux gradients osmotiques. Les AQPs sont essentiellement régulées par le trafic. Parmi les AQPs, l’Aquaporine-5 (AQP5) apparaît comme un membre particulièrement important. En effet, l’AQP5 s’impose comme un acteur clé du flux d’eau, essentiel aux fonctions physiologiques dans plusieurs tissus essentiels, notamment dans les glandes exocrines où elle joue un rôle essentiel dans la sécrétion de salive. De plus, les effets de l’AQP5 s’étendent au-delà de sa fonction de canal à eau, comme en témoigne son rôle dans divers processus biologiques via des interactions protéine-protéine et l’activation de voies de signalisation. La dérégulation de l’AQP5 est impliquée dans plusieurs maladies, notamment le syndrome de Sjögren primaire (pSS), une maladie auto-immune caractérisée par des infiltrations inflammatoires des glandes salivaires et lacrymales, entraînant souvent un dysfonctionnement glandulaire. Par conséquent, il est nécessaire de comprendre les mécanismes moléculaires régissant la fonction, le trafic et les interactions de l’AQP5 avec d’autres composants cellulaires.La recherche menée dans le cadre de cette thèse de doctorat se concentre sur les mécanismes complexes de régulation du trafic de l'AQP5, en mettant l'accent sur le rôle de l’extrémité C-terminale et l'implication de la protéine inductible par la prolactine (PIP), un partenaire d'interaction clé dans le trafic de l'AQP5. Pour évaluer la localisation de l'AQP5 dans la membrane plasmique, un modèle cellulaire 2D innovant a été développé et validé dans une lignée cellulaire acineuse de glande salivaire en utilisant un SNAP-tag et la microscopie à fluorescence couplée à une méthodologie automatisée basée sur un algorithme crée en interne. En utilisant des constructions tronquées du domaine C-terminale de l’AQP5, nous avons révélé des réponses spécifiques à l'augmentation intracellulaire de l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) et du calcium, soulignant l'importance de sites spécifiques dans l’extrémité C-terminale pour le trafic d'AQP5. En outre, l'étude de l'interaction entre l'AQP5 et la PIP a révélé le rôle de la PIP dans la translocation de l'AQP5 vers la membrane plasmique, tout en évaluant les effets des voies de signalisation dépendantes du calcium et de l'AMPc sur la localisation subcellulaire de l'AQP5.De plus, nos travaux de recherche ont identifié CLIP2, une protéine de liaison cytoplasmique, comme un nouveau partenaire d'interaction avec l'AQP5. La co-immunoprécipitation couplée à la spectrométrie de masse et à la thermophorèse à micro-échelle a confirmé l'interaction directe entre AQP5 et CLIP2. La modélisation structurelle de l’interaction AQP5-CLIP2 a révélé des similitudes avec d'autres complexes à domaines CAP-Gly, soulignant la complexité de la régulation de l'AQP5. L'exploration fonctionnelle a révélé que CLIP2 influence de manière significative le trafic de l'AQP5, formant potentiellement des complexes multiprotéiques avec d'autres partenaires protéiques de l’AQP5 dans les glandes salivaires. Dans le pSS, les altérations observées dans les interactions AQP5-CLIP2 et la présence d'auto-anticorps dirigés contre ces protéines soulignent leur implication dans la pathologie du pSS et offrent des cibles thérapeutiques potentielles pour de futures interventions thérapeutiques.