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Diving into new mRNA modifications identification and regulation: From writer to reader

par Martin, Jérôme
Président du jury Langer, Ingrid
Promoteur Fuks, François
Publication Non publié, 2023-05-09

Thèse de doctorat

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Résumé :

For many years epigenetics was defined by three pillars: DNA methylation, histone modifications, and ncRNA regulation. But recently, the development of next-generation sequencing and more sensitive mass spectrometry unveiled the presence of novel mRNA modifications. This new field of RNA epigenetics was then referred to as epitranscriptomics.During the golden age of epitranscriptomics, many new mRNA modifications were identified. Thanks to its abundance, m6A persists until now as the reference, with the discovery of complete enzymatic machinery (writers, readers, and erasers) as well as functions in physiology and pathology. However, the very existence of the other mRNA modifications remains under debate due to the high error rates in the sequencing technologies, the low specificity of new methods developed, and the poor reproducibility between the different epitranscriptomics studies. Thus, the aim of this thesis is to dive into the identification of new mRNA modifications through the prism of the writers and readers.In the first part of the thesis, by using the RNA biotin pull-down method, we uncovered promising readers from two mRNA modifications: FUBP3 for inosine and CSDE1 for m5U. Then, we further described the direct binding of FUBP3 to hyper-edited oligonucleotides.In the second part of the thesis, we developed and optimized new sequencing techniques, based on the TRMT2A writer to study the distribution of m5U in mRNA. Here, we provide the first transcriptome-wide list of around one thousand transcripts that are bound and m5U modified by TRMT2A. Moreover, we challenged the recently described Nanopore technology to map m5U at a single-nucleotide level. Using two different bioinformatic tools, we obtained a list of confident m5U peaks that need to be confirmed by primer extension.Lastly in the third part, we confirmed that CSDE1 acts as a reader of the m5U modification. We also showed that the depletion of TRMT2A induces changes in the transcriptome and proteome and affects genes linked with extracellular matrix and actin organization, focal adhesion, cell cycle, and DNA damage response. Moreover, we demonstrated for the first time that the presence of m5U on mRNA seems to affect their translation. Finally, we confirmed that TRMT2A acts as an oncogene that promotes proliferation and migration while its depletion induces a drastic change in actin cytoskeleton organization.In conclusion, our findings support the presence of new modifications on mRNA and provide new insight into the global landscape of epitranscriptomics modifications. In addition, our results bring new considerations on how to approach the identification of new mRNA modifications as well as the characterization of their role in physiology and pathology.

Durant de nombreuses années, l’épigénétique était définie par trois piliers : la méthylation de l’ADN, les modifications d’histone et la régulation par ARN non codant. Récemment, le développement de nouvelles technologies de séquençage et de spectrométries de masse plus sensibles a dévoilé la présence de nouvelles modifications d’ARNm. Ce nouveau domaine de recherche lié à l’épigénétique des ARN est appelé épitranscriptomique. Durant l’âge d’or de l’épitranscriptomique, une dizaine de nouvelles modifications d’ARN a été identifiée. Grâce à son abondance, m6A reste jusqu’à ce jour la référence avec la découverte d’une machinerie enzymatique complète (writers, readers et erasers) ainsi que des fonctions en physiologie et pathologie. Cependant, l’existence même des autres modifications d’ARNm reste débattue à cause notamment du haut taux d’erreur des techniques de séquençage et de la faible spécificité des nouvelles méthodes développés. Donc, le but de cette thèse est de plonger dans le monde des nouvelles modifications d’ARNm par le biais des writers et readers.Dans cette première partie de thèse, en utilisant la méthode du biotin pull-down, nous avons identifié des readers prometteurs pour deux modifications d’ARNm : FUBP3 pour l’inosine et CSDE1 pour m5U. Ensuite, nous avons caractérisé davantage la liaison directe de FUBP3 à un oligonucléotide hyper-édité.Dans la deuxième partie, nous avons développé et optimisé de nouvelles techniques de séquençage basées sur le writer TRMT2A afin d’étudier la distribution de m5U dans les ARNm. Ici, nous présentons la première liste transcriptomique d’environ mille transcrits qui sont liés et modifié m5U par TRMT2A. De plus, nous avons testé la récente technologie du Nanopore afin de cartographier la position de m5U au nucléotide près. En utilisant deux outils bioinformatiques, nous avons obtenu une liste de piques m5U qui doivent être prochainement confirmés par la méthode du primer extension. Enfin, dans la troisième partie, nous avons confirmé que CSDE1 agit comme un reader de m5U. Nous avons également montré que la déplétion de TRMT2A induit des changements au niveau transcriptomique et protéomique et affecte des gènes liés à l’organisation de la matrice extracellulaire et de l’actine, l’adhésion focale, le cycle cellulaire et la réponse aux dommages à l’ADN. De plus, nous avons démontré pour la première fois que la présence de m5U sur les ARNm affect leur traduction. Finalement, nous avons confirmé que TRMT2A agit en tant qu’oncogène en améliorant la prolifération et la migration alors que sa déplétion induit un changement drastique dans l’organisation du cytosquelette d’actine.En conclusion, nos découvertes soutiennent l’existence des nouvelles modifications d’ARNm et fournissent un nouveau regard sur le paysage global des marques épitranscriptomiques. En outre, nos résultats apportent de nouvelles considérations sur la manière d’approcher l’identification des nouvelles modifications ainsi que la caractérisation de leur rôle physiologique et pathologique.