Résumé : The development of biological sensing devices i.e., biosensors is a very promising and flourishing field of pharmaceutical research with very broad applications. As reported by many scientific publications, their very high practicality makes them valuable tools for the detection of specific biomarkers involved in pathologies such as Alzheimer’s or cardiovascular disease. In this work, we show that biosensors are not only useful for diagnosis purposes but are also an alternative method of choice for online bioprocess monitoring of mAb (monoclonal antibody).The quality control of pharmaceutical drugs is intended to ensure the safety, efficiency, and consistency of production batches. Although being the gold standard method for quality control of biopharmaceutical drugs, LC-MS (liquid chromatography coupled to mass spectrometry) is a heavy, expensive, and time-consuming method requiring cleavage and labeling steps to monitor the different critical quality attributes (CQAs) of a mAb. The research developed in this thesis describes the development of a new type of versatile biosensor based on ATR-FTIR (Attenuated Total Reflection – Fourier Transform Infrared) spectroscopy. Our results showed that this biosensor can detect and analyze simultaneously some important CQAs of the mAb directly from its complex medium (e.g., culture medium, pharmaceutical formulation) quickly, easily and without labeling of any kind.In the first part of this work, a germanium crystal used as IRE (internal reflection element) has been functionalized to allow covalent protein grafting. By grafting immunoglobulin-binding proteins (protein A-like), the biosensor can capture the antibody on the germanium surface allowing to obtain its specific FTIR spectrum. Binding experiments were carried out to test the attachment of various mAbs in different media to analyze the robustness of the biosensor. We have demonstrated that, regardless of the medium, we can extract the IR spectrum of the antibody and that this corresponds to the spectrum that could be obtained from the purified antibody.The second part of this work consisted in the FTIR analysis of the glycosylation, a major CQA, of rhEPO (recombinant human erythropoietin). The results obtained were compared with those obtained by LC-MS. We were able to show that the clusters between batches observed by LC-MS could be identified as well by FTIR spectroscopy. Moreover, by grafting proteins from the lectin family onto the germanium surface, we have shown that it is possible to attach and analyze glycosylated proteins such as rhEPO and that it is possible to eliminate certain stubborn excipients (such as polysorbate) contained in pharmaceutical formulations interfering with IR measurements.Our investigations led us to conclude that the ATR mode is a perfectly suitable method that allows precise monitoring of monolayer grafting compounds and by extension is a very sensitive technique for the direct analysis of biomolecules in complex media.In parallel to these experiments, another type of biosensor based on single-walled carbon nanotubes (SWCNTs) was developed in partnership with various Belgian universities. Our contribution to the project was the demonstration of reproducible grafting of an antibody onto carbon nanotubes using chemistry similar to the one developed for our infrared biosensor. These investigations illustrate the practicality and applicability of such biosensors and their interests in the field of medical diagnosis and online quality control of biopharmaceutical products.
Le développement de dispositifs de détection biologique, c'est-à-dire de biosenseurs, est un domaine très prometteur et florissant de la recherche pharmaceutique avec des applications très larges. Comme le rapportent de nombreuses publications scientifiques, leur très grande praticité en font des outils intéressants pour la détection de biomarqueurs spécifiques impliqués dans des pathologies telles que la maladie d'Alzheimer ou les maladies cardiovasculaires. Dans ce travail, nous montrons que les biosenseurs sont non seulement utiles à des fins de diagnostic, mais sont également une méthode alternative de choix pour la surveillance en ligne des bioprocédés d’anticorps monoclonaux (mAb).Le contrôle qualité des produits pharmaceutiques vise à assurer la sécurité et l'efficacité des lots de production. Bien qu'étant la méthode de référence, la LC-MS (chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse) est une méthode lourde, coûteuse et chronophage nécessitant des étapes de clivage et de marquage pour contrôler les différents attributs qualité critiques (CQA) d’un anticorps monoclonal. Nos travaux de recherche décrivent le développement d'un nouveau type de biosenseur polyvalent basé sur la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) par réflexion totale atténuée (ATR). Nos résultats ont montré que ce biosenseur peut détecter et analyser simultanément certains CQA importants d’une biomolécule pharmaceutique directement à partir de son milieu complexe (milieu de culture, formulation pharmaceutique) rapidement, facilement et sans marquage d'aucune sorte.Dans la première partie de ce travail, un cristal de germanium, utilisé comme élément de réflexion interne (IRE), a été fonctionnalisé pour permettre le greffage covalent de protéines. En greffant des protéines liant spécifiquement les immunoglobulines (type protéine A), le biosenseur peut capturer l'anticorps sur la surface de germanium permettant d'obtenir son spectre FTIR spécifique. Des expériences de greffage ont été réalisées pour tester la fixation de divers anticorps monoclonaux dans différents milieux afin d'analyser la robustesse du biosenseur. Nous avons démontré que, quel que soit le milieu, il est possible d’extraire le spectre infrarouge de l'anticorps et que celui-ci correspond au spectre que l'on pourrait obtenir à partir de l'anticorps purifié.La deuxième partie de ce travail a consisté en l'analyse par FTIR de la glycosylation, un CQA majeur, de l’érythropoïétine humaine recombinante (rhEPO). Les résultats obtenus ont été comparés à ceux obtenus par LC-MS. Nous avons pu montrer que les groupes entre les lots observés par LC-MS pouvaient également être identifiés par spectroscopie FTIR. De plus, en greffant des protéines de la famille des lectines sur la surface du germanium, nous avons montré qu'il était possible de fixer et d'analyser des protéines glycosylées comme la rhEPO et qu'il était possible d'éliminer certains excipients tenaces (comme le polysorbate) contenus dans les formulations pharmaceutiques interférant avec les mesures infrarouges.Nos investigations nous ont amenés à conclure que le mode d’acquisition par ATR des spectres infrarouges est une méthode parfaitement adaptée qui permet un suivi précis des composés greffés en monocouche et par extension est une technique très sensible pour l'analyse directe de biomolécules dans des milieux complexes.Parallèlement à ces expérimentations, un autre type de biosenseur à base de nanotubes de carbone mono-parois (SWCNT) a été développé en partenariat avec différentes universités belges. Notre contribution au projet a été la démonstration du greffage reproductible d'un anticorps sur des nanotubes de carbone en utilisant une chimie similaire à celle développée pour notre biosenseur infrarouge. Ces investigations illustrent la praticité et l'applicabilité de tels biosenseurs ainsi que leurs intérêts dans le domaine du diagnostic médical et du contrôle qualité en ligne des produits biopharmaceutiques.