par Dionisi, Chiara 
Président du jury Remmelink, Myriam
Promoteur Schiffmann, Serge N.
Publication Non publié, 2022-06-07
Président du jury Remmelink, Myriam
Promoteur Schiffmann, Serge N.
Publication Non publié, 2022-06-07
Thèse de doctorat
| Résumé : | Friedreich Ataxia (FRDA) is an autosomal recessive multisystem disorder with prominent neurological manifestations, which include the early and severe loss of large primary proprioceptive neurons (PPNs) of the Dorsal Root Ganglia (DRGs) and, at a later stage, the degeneration of cerebellar and pyramidal systems. The disease is caused by the hyperexpansion of a GAA triplet repeat in the first intron of the FXN gene, encoding the mitochondrial protein frataxin (FXN), which is involved in iron-sulfur cluster biogenesis. The expanded GAA tract promotes chromatin condensation and disrupts FXN mRNA transcription, leading to reduced FXN levels, impaired mitochondrial function and altered iron metabolism. Despite notable progress in the identification of the underlying causes of FRDA, neither the details of these pathogenic processes nor the reason for the specific vulnerability of the proprioceptive system and a limited number of other cell types are yet fully understood. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) are used to generate models of human diseases that recapitulate the pathogenic process as it occurs in affected cell types. Studies conducted so far in FRDA have mainly utilized iPSC-derived cortical neurons and cardiomyocytes, which have shown to recapitulate essential aspects of FRDA pathogenesis that are at least partially corrected by restoring FXN expression. However, those studies can only provide a limited view of the effects that FXN silencing has in vivo, because the neuronal type utilized so far is not affected in FRDA patients. On the other side, efforts to differentiate iPSCs into primary sensory neurons have only succeeded in generating an unselected mixed neuronal population with a small minority of proprioceptors.Having an in vitro source of PPNs would enable the study of the alterations which are specifically induced and the pathways which are impaired by frataxin deficiency in these cells, helping in the understanding of their unique neuronal properties and their specific vulnerability in FRDA.To this end, in this thesis, we developed a protocol for the differentiation of human iPSCs into proprioceptive neurons. We used a combination of small molecules and neurotrophic factors to modulate the pathways involved in the differentiation of DRG neurons, obtaining primary sensory cultures highly enriched for proprioceptors, which represented 60-70% of differentiated cells, as assessed by immunostaining and flow cytometry. We could robustly induce the transcription factors involved in sensory neurogenesis, driving the differentiation of iPSCs into cells expressing specific markers of DRG neurons. Furthermore, differentiated neurons could establish mature networks and were capable of firing and sustaining regular action potentials in just three weeks after plating, which is much faster than what is usually observed with iPSC-derived neurons. The protocol was used to successfully differentiate iPSCs derived from healthy controls as well as FRDA patients. Throughout the differentiation process, FRDA cells expressed 3-4-fold lower levels of FXN mRNA than control lines, confirming the continued inhibition of FXN expression by the expanded GAA repeats. However, we could not detect any obvious defects in the acquisition of the proprioceptive phenotype or susceptibility to cell death in FRDA neurons compared to controls. The second aim of the thesis was to fully characterize the pathological features of FRDA proprioceptive neurons in comparison to healthy controls and to investigate if removal of expanded GAA repeats could fully correct the phenotype of FRDA cells. For this purpose, we took advantage of the use of Isogenic Control (IC) lines, gene-edited cell lines from FRDA patients where the GAA expansion mutation had been removed by direct excision of the intronic region flanking the mutation or by homologous recombination with a correct intronic sequence. As previously reported in cellular and animal models of FRDA, we detected repressive histone marks and DNA hypermethylation in FRDA PPNs upstream of the GAA repeats at the FXN locus, overall confirming a repressive chromatin status in those cells.Transcriptional and proteomic analyses indicated an impaired development of primary sensory neurons in FRDA, eventually mostly affecting mature PPNs, but already detectable at an early differentiation stage. FRDA cells displayed dysregulation of pathways involved in the organization of axonal cytoskeleton, axonal trafficking and synaptic activity, along with an upregulation of markers of autophagy and lysosomal activity and with genetic instability. Correspondingly, morphological analysis of neuronal cultures confirmed the irregular extension of FRDA axons, which displayed a tortuous and twisting course. Removal or replacement of the GAA expansion mutation in IC lines partially corrected the FRDA epigenetic signature and restored FXN expression. However, despite normal FXN levels, IC neurons mostly resembled FRDA cells in their transcriptomic and proteomic profiles. Finally, the electrophysiological analysis of mature proprioceptors revealed irregular firing properties in FRDA and IC neurons.Taken together, our results suggest that FRDA PPNs may be impaired in extending their axons towards their targets and to transmit proper signals at the synaptic level. Further investigations are needed to highlight the mechanistic link between FXN silencing and proprioceptive deficits in FRDA. However, by identifying a limited number of proteins and pathways which were altered in FRDA, our study has narrowed this field of investigation, thus providing a guide for deeper and more detailed analyses in future studies. |
| L'ataxie de Friedreich (FRDA) est une pathologie héréditaire autosomale récessive caractérisée par des manifestations neurologiques importantes, qui comprennent la perte précoce et sévère des neurones proprioceptifs (PPN) des ganglions de la racine dorsale (DRG) et, à un stade ultérieur, l’atteinte des systèmes cérébelleux et pyramidaux.La maladie est causée par une expansion de triplets nucléotidiques GAA au sein du premier intron du gène FXN, qui code pour la protéine mitochondriale frataxine (FXN), impliquée dans la biogenèse des centres fer-soufre (Fe-S). Cette expansion GAA induit la formation d’hétérochromatine et perturbe la transcription du gène FXN, entraînant une réduction des niveaux de frataxine, une altération de la fonction mitochondriale et une altération du métabolisme du fer. Malgré des progrès notables dans l'identification des causes de la maladie, ni les détails de ces processus pathogènes ni la raison de la vulnérabilité spécifique du système proprioceptif et d'un nombre limité d'autres types de cellules ne sont encore entièrement élucidés.Les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont utilisées pour générer des modèles de maladies humaines qui récapitulent le processus pathogénique tel qu'il se manifeste dans les cellules affectées. Les études menées jusqu'à présent dans l’ataxie de Friedreich ont principalement utilisé des neurones corticaux et des cardiomyocytes dérivés des iPSC FRDA, qui présentent les aspects essentiels de la pathogenèse de FRDA, qui sont partiellement corrigés après la restauration de l’expression du gène FXN. Cependant, ces études ne peuvent fournir qu'une vision limitée des effets de la diminution de la transcription du gène FXN, car le type neuronal utilisé n'est pas affecté dans la maladie. D'autre part, les efforts pour différencier les iPSC en neurones sensoriels primaires n'ont réussi qu'à générer une population neuronale mixte avec une faible proportion de neurones de type proprioceptif. Disposer d'une source in vitro de PPN permettrait d'étudier les altérations induites par le déficit de la frataxine dans ces cellules, aidant à comprendre leurs propriétés neuronales uniques et leur vulnérabilité spécifique dans l’ataxie de Friedreich.Dans la première partie du projet, nous avons développé un protocole de différenciation des iPSC humaines en neurones proprioceptifs. Nous avons utilisé une combinaison de petites molécules et de facteurs neurotrophiques pour moduler les voies impliquées dans la différenciation des neurones DRG et nous avons généré des cultures cellulaires sensorielles primaires avec 60-70% de neurones proprioceptifs, taux évalué par immunocytochimie et cytométrie en flux. Nous avons induit les facteurs de transcription impliqués dans la neurogenèse sensorielle, entraînant la différenciation des iPSC en cellules exprimant des marqueurs spécifiques des neurones DRG. De plus, les cellules différenciées pouvaient établir des réseaux neuronaux matures et étaient capables de générer des potentiels d'action réguliers en seulement trois semaines, ce qui est beaucoup plus rapide que ce qui est généralement observé avec les neurones dérivés de iPSC. Le protocole a été utilisé pour différencier avec succès les iPSC dérivées de sujets sains ainsi que de patients FRDA. Tout au long du processus de différenciation, les cellules FRDA ont montré une répression de l'expression du gène FXN avec des niveaux d'ARNm FXN 3 à 4 fois inférieurs à ceux des lignées saines. Cependant, nous n'avons pu détecter aucun défaut évident dans l'acquisition du phénotype proprioceptif ou une plus grande susceptibilité à la mort cellulaire dans les neurones FRDA par rapport aux contrôles sains.Dans la deuxième partie du projet, nous avons analysé les caractéristiques pathologiques des neurones proprioceptifs FRDA par rapport aux contrôles sains et nous avons également évalué les effets induit par l’excision des expansions GAA. À cette fin, nous avons utilisé des contrôles isogéniques (IC), qui sont des modèles cellulaires générés à partir de iPSC FRDA par excision directe de la région intronique flanquant la mutation ou par recombinaison homologue avec une séquence intronique correcte.Conformément à d'autres modèles cellulaires et animaux de FRDA, nous avons détecté la présence d’hétérochromatine en amont de l’expansion GAA. Les analyses transcriptionnelles et protéomiques ont indiqué une altération du développement des neurones sensoriels primaires dans FRDA, affectant finalement les PPN matures, mais déjà détectable à un stade précoce de différenciation. Les cellules FRDA ont présenté une dérégulation des voies impliquées dans l'organisation du cytosquelette axonal, du trafic axonal et de l'activité synaptique, ainsi qu'une augmentation de l'activité lysosomale et une instabilité génétique. L'analyse morphologique des cultures neuronales a confirmé l'extension irrégulière des axones FRDA, qui affichaient un parcours tortueux. L'élimination ou le remplacement de l’expansion GAA dans les lignées IC a partiellement corrigé la signature épigénétique FRDA et restauré l'expression du gène FXN. Cependant, malgré des niveaux normaux de FXN, les neurones IC ressemblaient principalement aux cellules FRDA dans leurs profils transcriptomiques et protéomiques. Enfin, l'analyse électrophysiologique des neurones matures a révélé une altération de la décharge des potentiels d’action dans les neurones FRDA et IC. Nos résultats suggèrent que les PPN FRDA ont des déficits d'extension des axones vers leurs organes cibles et de transmission de signaux appropriés au niveau synaptique. Des investigations supplémentaires sont nécessaires pour mettre en évidence le lien existant entre la réduction de l’expression du gène FXN et les déficits proprioceptifs dans l’ataxie de Friedreich. Cependant, en identifiant un nombre limité de protéines et de voies altérées dans les neurones FRDA, nous avons restreint ce champ d'investigation, fournissant ainsi un guide pour des analyses plus détaillées dans des études ultérieures. |
