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The double knockout of myotubularin 1 and amphiphysin 2 in zebrafish recapitulates the skeletal muscle phenotype of human centronuclear myopathy

par Dupuis, Eléonore
Président du jury Braun, Michel Y
Promoteur Costagliola, Sabine
Publication Non publié, 2022-03-08

Thèse de doctorat

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Résumé :

Centronuclear myopathies (CNMs) are a group of rare and early-onset genetic muscle disorders for which there is no curative treatment. This fatal disease is known to be caused by mutations in several genes, including myotubularin (MTM1) and amphiphysin 2 (BIN1). Mutations in the MTM1 gene cause X-linked myotubular myopathy (XLCNM), which is the most common and severe form of CNM. In addition, mutations in the BIN1 gene have been associated with autosomal dominant and recessive CNM, a late-onset myopathy that is usually less severe. Several defects at the cellular level have been observed in CNM, such as abnormal triad structure and impaired excitation-contraction coupling, which is critical for skeletal muscle contraction.In our laboratory, we generated mtm1 zebrafish knockout mutants (KO) using CRISPR/Cas9 technology. These mtm1KO mutant show progressive degeneration of fin folds, defective motor behavior, and early mortality. However, no defects in muscular ultrastructure were observed. Recent studies have shown that mutant mRNA can trigger genetic compensation. To avoid this compensation and any active transcription of the mutant mRNA, we generated mtm1 mutant that has a large deletion encompassing the entire promoter of the mtm1 gene. Surprisingly, this promoterless (PL) mutant shows a similar phenotype to the KO mutants, including the lack of a muscle phenotype. This result suggests that no compensation was induced in the KO mutant. We also generated a bin1b mutant lacking a promoter (bin1bPL), in which we found no differences from WT larvae and adult fish. These two mutants challenge the roles of mtm1 and bin1b in zebrafish muscle. Finally, we generated an mtm1-bin1b mutant lacking a double promoter (DPL). This zebrafish mutant not only shows the same features as the mtm1PL mutants, but also exhibits severe muscle defects at both the structural and functional levels that recapitulate human CNM.In summary, we have generated a zebrafish mutant that exhibits a strong muscle phenotype. Two genes separately involved in CNM are deleted in this mutant, suggesting that genetic robustness may be more efficient in zebrafish than in humans. Moreover, this new zebrafish model could be an excellent tool to better understand the physiopathology of CNM and to develop more effective therapeutic approaches.

Les myopathies centronucléaires (CNM) définissent un groupe de maladies musculaires génétiques rares et à apparition précoce pour lesquelles aucun traitement curatif n'est disponible actuellement. Des mutations dans plusieurs gènes, notamment la myotubularine (MTM1) et l'amphiphysine 2 (BIN1) causent ces maladies létales. Les mutations du gène MTM1 sont à l'origine de la myopathie myotubulaire liée à l'X (XLCNM), qui est la forme la plus fréquente et la plus grave de CNM. D’autre part, des mutations dans le gène BIN1 ont été associées à des CNM autosomiques dominantes et récessives qui sont généralement moins graves et se manifestent plus tardivement chez les patients. Dans la CNM, plusieurs défauts ont été observés au niveau cellulaire, comme une structure anormale des triades et un dysfonctionnement du couplage excitation-contraction, crucial pour la contraction des muscles squelettiques.Dans notre laboratoire, nous avons généré un mutant mtm1 knockout (KO) de poisson zèbre en utilisant la technologie CRISPR/Cas9. Ce mutant mtm1KO présente une dégénérescence progressive des nageoires, une diminution du comportement moteur et une mortalité précoce. Cependant, aucun défaut dans l'ultrastructure musculaire n'a été observé chez ce mutant, contrairement à ce qui était attendu. Des études récentes ont montré, dans différents modèles, que l’expression d’ARNm mutés peut déclencher une compensation génétique et une réduction de la gravité ou une absence du phénotype attendu. Pour éviter cette compensation et toute transcription d’ARNm muté, nous avons généré des mutants mtm1 portant de larges délétions englobant la totalité du promoteur du gène mtm1. De manière surprenante, ce mutant sans promoteur (« promoterless mutant », PL) présente un phénotype similaire au mutant KO, y compris par l'absence de phénotype musculaire. Ce résultat suggère qu'aucune compensation n'a été déclenchée chez le mutant KO. Nous avons également généré un mutant présentant une absence de promoteur du gène bin1b, identifié comme étant l’orthologue de BIN1. Nous n'avons détecté aucune caractéristique différente chez ces mutants en comparaison avec des larves et des poissons adultes WT. Les résultats obtenus avec ces deux mutants remettent en question les rôles de mtm1 et bin1b dans le muscle du poisson zèbre. Cependant, nous avons également généré, par croisement de ces deux lignées PL, un mutant (DPL) où l’expression des deux gènes mtm1 et bin1 est invalidée. Ce dernier mutant DPL, non seulement présente les mêmes caractéristiques décrites chez le mutant mtm1PL, mais également des défauts sévères tant au niveau de la structure que de la fonction musculaire, récapitulant la maladie humaine.En conclusion, nous avons généré un modèle de poisson-zèbre présentant des défauts musculaires sévères, semblables à ceux observés chez les patients CNMs. Afin d’obtenir ce phénotype musculaire, les expressions de deux gènes impliqués séparément dans la CNM ont été supprimées dans ce mutant, ce qui suggère une robustesse génétique plus efficace chez le poisson-zèbre que chez l'homme. De plus, ce nouveau modèle de poisson zèbre pourrait constituer un excellent outil pour mieux comprendre la physiopathologie des CNMs et pour le développement d'approches thérapeutiques plus efficaces.