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Caractérisation et rôles potentiels des "Calcium-Binding Proteins" dans l’acquisition du pouvoir fécondant des spermatozoïdes

par Dressen, Cindy
Président du jury Brion, Jean Pierre
Promoteur Lybaert, Pascale
Co-Promoteur Lebrun, Philippe
Publication Non publié, 2020-07-07

Thèse de doctorat

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Résumé :

La fécondation dépend de la capacité de deux cellules uniques à s’unir : l’ovocyte et le spermatozoïde. Alors que le stock d’ovocytes est établi dès la puberté, les spermatozoïdes sont produits de façon continue à partir d’une réserve de cellules germinales souches (spermatogonies). Immobile et inapte à la fécondation, le spermatozoïde testiculaire doit subir un processus de maturation qui débute dans l’épididyme et se poursuit dans les voies génitales femelles. Bien qu’une première forme de mobilité soit acquise au contact du fluide épididymaire, le spermatozoïde subit, tout au long de son parcours dans le tractus femelle, de nombreuses modifications structurelles et biochimiques appelées « capacitation » et qui s’avèrent indispensables à l’acquisition de son pouvoir fécondant. La production de spermatozoïdes fertiles est un processus hautement régulé, notamment via l’ion calcium ; second messager crucial de nombreux processus de signalisation intracellulaire. Les modifications de la concentration intracellulaire de calcium sont indispensables pour le développement du potentiel de fécondation du sperme via la modification du profil de mobilité vers l’hyperactivation ou encore la réalisation de la réaction acrosomiale. Différents mécanismes de régulation de la concentration intracellulaire calcique ont déjà été mis en évidence dans les spermatozoïdes : canaux calciques, réserves intracellulaires de calcium… Toutefois, peu d’informations relatent la présence et/ou l’implication de protéines liant le calcium (Calcium-Binding Proteins - CaBP) au sein de ce type cellulaire.Notre étude a pour but de caractériser la présence et l’implication potentielle de EF-Hand CaBP dans l’acquisition du pouvoir fécondant des spermatozoïdes murins. Nous nous sommes principalement focalisés sur l’étude de trois membres de cette famille protéique : la calrétinine, la calbindine D-28k et la parvalbumine. Nos investigations ont été menées de manière comparative entre des spermatozoïdes de type Wild-type (WT) et des spermatozoïdes n’exprimant pas une ou plusieurs CaBP (calrétinine knock-out - CR-/-, calbindine D-28k - knock-out CB-/-, triple knock-out pour la calrétinine, la calbindine D-28k et la parvalbumine - CR-/-CB-/-PV-/-). La première partie de notre projet décrit la localisation et l’expression de la calrétinine, la calbindine D-28k et la parvalbumine dans les spermatozoïdes de souris et de rats par immunofluorescence et Western blotting. Ces protéines ont été localisées au niveau de la pièce principale du flagelle et au niveau de la Redundant Nuclear Envelope dans le cas de la parvalbumine. Au cours de la seconde partie du projet, des études de mobilité ainsi que des quantifications du taux de réaction acrosomiale ont été menées en comparant les spermatozoïdes WT aux cellules CR-/- et CR-/-CB-/-PV-/-. Alors qu’aucune différence n’a été constatée entre les taux de réaction acrosomiale WT versus knock-out tant en condition basale qu’induite, l’absence d’une ou plusieurs protéines apparaît influencer certains paramètres de mobilité des spermatozoïdes. En effet, les spermatozoïdes CR-/- et CR-/-CB-/-PV-/- ont présenté une fréquence du battement de flagelle (BCF) plus élevée par rapport à la fréquence mesurée chez les spermatozoïdes WT, paramètre modifié notamment au cours de l’hyperactivation. Cette différence pourrait être liée à une modification du tamponnage calcique ou à une régulation différente du canal calcique CatSper, acteur majeur du développement de l’hyperactivation. Les résultats préliminaires des mesures électrophysiologiques suggèrent un rôle potentiel de la calrétinine dans la régulation de l’activité de ce canal. Par ailleurs, la comparaison entre le nombre de petits par portées WT par rapport aux portées CR-/- ou CR-/-CB-/-PV-/- a indiqué que l’absence d’expression d’une ou plusieurs EF-Hand CaBP réduisait le nombre de naissances par portée au sein des génotypes knock-out.En conclusion, l’ensemble de nos résultats expérimentaux ont démontré la présence de trois EF-Hand CaBP au niveau des spermatozoïdes murins et permis d’apporter de nouvelles informations quant à l’implication potentielle de celles-ci dans l’acquisition du pouvoir fécondant des spermatozoïdes.