• Citer

Conformational kinetics and dynamics of the secondary multidrug transporter LmrP

par Roth, Aurélie
Président du jury Goormaghtigh, Erik
Promoteur Govaerts, Cédric
Co-Promoteur Hendrix, Jelle
Publication Non publié, 2019-12-20

Thèse de doctorat

• Accès en ligne
• Détails
• Contenu
• Statistiques

Résumé :

Le transport sélectif d’ions ou de molécules à travers la membrane plasmique d’une cellule est assuré par des transporteurs membranaires. La Major Facilitator Superfamily (MFS) regroupe la majorité des transporteurs secondaires. Parmi les MFS, les transporteurs multidrogues constituent une classe à part entière puisqu’ils sont capables de transporter des substrats de structures variées. LmrP est un transporteur secondaire multidrogue naturellement exprimé par la bactérie à gram positif Lactococcus lactis. La compréhension du mécanisme de transport de cette protéine permettrait d’obtenir des informations sur le transport secondaire des MFS et sur le mécanisme du transport multidrogue qui joue un rôle dans la résistance bactérienne aux antibiotiques.Un modèle de transport a déjà été proposé pour LmrP grâce à des mesures de distances réalisées en détergent par DEER (Double Electron Electron Resonance). Le rôle des lipides sur l’équilibre conformationnel a également été mis en évidence grâce à cette technique, et la structure de la protéine a récemment été résolue, offrant davantage d’informations sur la liaison du substrat ainsi que la reconnaissance multidrogue. Malgré cette importante caractérisation, ce modèle reste encore incomplet puisqu’il ne tient pas compte de la dynamique de la protéine ni d’effets cinétiques. De plus, dans la membrane bactérienne, LmrP utilise un gradient de protons comme source énergétique pour le transport de substrats. Toutefois, toutes les mesures ont jusqu’à présent été réalisées à pH constant, et le modèle actuel prédit que l’état de repos ne peut être observé dans ces conditions. Afin de compléter ce modèle, nous avons utilisé une méthode de fluorescence sur molécule isolée (smFRET) qui permet, en plus des distributions de distances, d’obtenir des constantes de vitesse de transition et d’identifier des conformations transitoires. Après optimisation de la préparation des échantillons, en plus de confirmer les résultats précédemment obtenus par DEER, nous avons évalué l’impact des ligands sur la cinétique conformationnelle de la protéine par smFRET. Etonnement, leur impact est différent sur la face cytosolique et extracellulaire de la protéine, suggérant que la protéine est en réalité très flexible. Les différents ligands testés ont également différents effets sur la cinétique de la protéine. La deuxième partie de cette thèse s’est axée sur un développement méthodologique pour reconstituer LmrP en protéoliposomes pouvant supporter un gradient de protons. Le but d’un tel système serait à terme de pouvoir réaliser des tests de transport quantitatifs, ainsi que de pouvoir étudier LmrP en présence d’un gradient de protons par smFRET pour isoler les états intermédiaires manquants au modèle de transport.Ce travail démontre que le smFRET est une excellente méthode pour étudier les protéines membranaires, et surtout, qu’il s’agit d’une méthode de choix pour obtenir des informations cinétiques généralement inaccessibles via des méthodes de caractérisation classiques. De plus, ce travail a permis d’optimiser la reconstitution de LmrP en protéoliposomes capables de maintenir un gradient de pH. -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Selective transport of ions or molecules across the membrane of a cell requires membrane proteins. The MajorFacilitator Superfamily (MFS) is the largest family of secondary transporters, all of them transporting substratesfollowing the alternating access model. Some of these transporters, multidrug (MDR) transporters, are particularas they can carry several structurally different substrates. LmrP is a secondary MFS MDR transporter naturallyexpressed by the Gram-positive bacteria Lactococcus lactis. Understanding its transport mechanism at themolecular level would allow the obtention of additional information on secondary and multidrug transport.A transport model has already been proposed for LmrP thanks to distance measurements realised in detergentusing DEER (Double Electron Electron Resonance). The role of the lipids on the conformational equilibrium hasalso been studied using this technique and the high-resolution structure of the protein in complex with thesubstrate Hoechst has been recently solved and offers details of substrate binding and multidrug recognition.However, despite this important characterisation, the transport model remains incomplete as it does notconsider the dynamics of the protein. It is therefore not possible to determine whether the observed functionalof structural effects are due to kinetics. Moreover, in bacterial membranes, LmrP uses the transmembraneproton gradient to energise the transport of substrates. All the biophysical characterisations have thus far onlybeen realised at a constant pH, and the current transport model predicts that the resting state cannot beobserved in such conditions.To validate and complete this model, we used FRET (Förster Resonance Energy Transfer) on single molecules(smFRET) that allows, in addition to distance distributions, the retrieval of transition rate constants and theidentification of transient and/or rare states. We monitored five distance reporters in detergent at different pHvalues, with and without ligand. One of these distance reporters was also reconstituted in nanodiscs to assessthe influence of the lipid bilayer.After the optimisation of sample preparation, despite the differences between smFRET and DEER (e.g. probesor frozen-state vs. freely diffusing molecules at room temperature), we first confirmed the DEER results, i.e., theprotein mostly adopts two conformations, inward-open and outward-open, in an equilibrium modulated by pH,substrate binding and specific mutations. We then characterised the impact of the ligands on the kinetics of thetransition between the conformations adopted by the protein. Surprisingly, the ligands affect the cytosolic andextracellular sides of the protein differently. Moreover, the different tested ligands modulate the transitionkinetics differently, and the prototypical Hoechst substrate even stabilised an extra-open state.The second part of this thesis focused on the methodological development of LmrP reconstitution inproteoliposomes able to maintain a pH gradient. In the end, the purpose of such a system would be to realisequantitative protein transport assays, as well as to study LmrP in the presence of a proton gradient using smFRETin order to isolate missing intermediate states in the transport model.This work demonstrates that smFRET is an excellent method to study membrane proteins and most importantly,is the method of choice to obtain kinetic information that is inaccessible through classical methods such as DEER,X-ray crystallography or cryo-EM. Additionally, this work has laid down the first optimisation steps towards LmrPreconstitution in proteoliposomes able to maintain a pH gradient.