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Characterization of the Role of Spa33 in Type 3 Secretion Regulation in Shigella flexneri

par Kadari, Mahendar
Président du jury Devière, Jacques
Promoteur Botteaux, Anne
Co-Promoteur Smeesters, Pierre
Publication Non publié, 2019-11-22

Thèse de doctorat

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Résumé :

Shigella is the causative agent of shigellosis, a severe diarrheal disease that causes more than one million deaths per year, mainly in low-income settings and among children under five years of age. The rapid increase of multi-drug resistant strains and the lack of vaccine make this pathogen a global health concern. Shigella invasion of colonic epithelium and further cell to cell spread is achieved by a specialized surface nano-syringe, called type 3 secretion system (T3SS). Shigella uses its T3SS to translocate virulence proteins directly inside the host cell where they interfere with multiple host-signalling cascades. The T3SS is composed of three major parts; a cytoplasmic complex (CC), a basal body and an extracellular needle. In the absence of contact with the eukaryotic cell, tip complex (TC) proteins, IpaB and IpaD, act as a plug at the top of the needle. MxiC, a gatekeeper protein, serves as an internal plug at the base of the T3SS to prevent the premature secretion of effectors. Upon host cell contact, IpaC and IpaB form a pore in the host cell plasma membrane, through which the effector proteins are delivered directly into the host cell cytosol for bacterial entry. Pore insertion generates an activation signal, which is sensed at the tip of the needle, and then transmitted through the needle subunits, MxiH and MxiI, to the base. This signal allows the secretion of MxiC and subsequently effectors release. Nevertheless, the identity of the cytoplasmic recipient, of the activation signal, is still unknown. The primary goal of this thesis was to characterize the role of Spa33, an essential component of the T3SS cytoplasmic complex. We have first discovered that 5 fragments with different sizes were expressed from the spa33 gene namely: Spa33FL (~33 kDa), Spa33C (~12 kDa), which was previously described, Spa33CC (~7 kDa), Spa33N (~11 kDa) and Spa33X (~10 kDa). We have shown that these fragments are arising from the internal start codons (Spa33C Spa33CC) or transcriptional slippage (Spa33N). We have demonstrated that Spa33CC is essential for T3SS function. We also observed that Spa33FL, Spa33C and Spa33CC interact with each other and forms a complex. Moreover, we have found that Spa33 is implicated in the T3 secretion hierarchy, by interacting with MxiC and MxiI. In a second part of the thesis, we have demonstrated that Spa33 is phosphorylated in vivo. We have addressed the impact of Spa33 phosphorylation in the regulation of secretion hierarchy by phosphomimetic and phosphoablative mutation of 5 potential phosphorylation-sites. Our analysis has revealed that phosphomimetic mutation of some residue (Y245, T101 and T167) abolishes the T3 secretion. Moreover, phosphoablative mutations of threonine residues lead to a decrease of MxiC and/or effectors secretion, strengthening our model in which Spa33 is implicated in the regulation of T3 secretion hierarchy upon activation of T3SS. Overall, our findings provide new insights about the regulation of T3SS secretion hierarchy and identify new players involved in the regulation of T3SS.

Shigella est l’agent responsable de la shigellose, une maladie diarrhéique grave qui provoque plus d’un million de décès par an, principalement dans les pays à faible revenu et chez les enfants de moins de cinq ans. L'augmentation du nombre souches multirésistantes aux antibiotiques etl’absence d’un vaccin efficace font de cet agent pathogène un problème de santé mondiale. L’invasion de l’épithélium colique par Shigella et sa dissémination dans ce dernier sont assurées par des structures spécialisées présentes à la surface bacétrienne appelées systèmes de sécrétion de type 3 (SST3). Shigella utilise le SST3 pour transloquer les protéines de virulence directement dans le cytoplasme de la cellule hôte, où elles interfèrent avec différentes cascades de signalisation cellulaire. Le T3SS est composé de trois parties principales; un complexe cytoplasmique (CC), un corps basal et une aiguille extracellulaire. En l'absence de contact avec la cellule eucaryote, deux protéines, IpaB et IpaD, localisées au sommet de l’aiguille, agissent comme un bouchon empechant la sécrétion prematurée des protéines de virulence. Lors du contact avec la cellule hôte, IpaC et IpaB forment un pore dans la membrane plasmique de la cellule hôte, à travers lequel les protéines effectrices sont délivrées directement dans le cytosol de la cellule hôte pour permettre l’entrée bactérienne. L'insertion des pores génère un signal d'activation, qui est détecté au sommet de l'aiguille, puis transmis à la base par les sous-unités de l'aiguille, MxiH et MxiI. Ce signal permet la sécrétion de MxiC, une protéine ’gatekeeper’ servant de bouchon interne à la base du T3SS. Sa sécrétion permet la libération d’une deuxième salve de protéines de virulence, appelées effecteurs. Néanmoins, la protéine recevant le signal d'activation au niveau cytoplasmique n’est, à ce jour,toujours pas identifiée. L'objectif principal de cette thèse fût de caractériser le rôle de Spa33, un composant essentiel du complexe cytoplasmique du SST3. Nous avons d’abord montré que 5 fragments de tailles différentes étaient exprimés à partir du gène spa33, à savoir : Spa33FL (~ 33 kDa), Spa33C (~ 12 kDa), décrit précédemment, Spa33CC (~ 7 kDa), Spa33N (~ 11 kDa) et Spa33X (~ 10 kDa). Nous avons montré que ces fragments provenaient de codons de démarrage alternatifs (Spa33C, Spa33CC) ou d’un glissement de transcription (Spa33N). Nous avons démontré que Spa33CC est essentiel à la fonction du SST3. Nous avons également observé que Spa33FL, Spa33C et Spa33CC interagissent et forment un complexe. De plus, nous avons montré que Spa33 est impliqué dans la hiérarchie de sécrétion, en interagissant avec MxiC et MxiI. Dans une deuxième partie de la thèse, nous avons montré que Spa33 est ? phosphorylée in vivo. Nous avons abordé l'impact de la phosphorylation de Spa33 sur la régulation de la hiérarchie de sécrétion en réalisant des mutations phospho-mimétiques et phospho-ablatives de 5 sites de phosphorylation potentiels. Notre étude a révélé que la mutation phospho-mimétique de certains résidus (Y245, T101 et T167) abolit la sécrétion de T3. De plus, les mutations phospho-ablatives des résidus thréonine entraînent une diminution de la sécrétion de MxiC et/ou des effecteurs, renforçant ainsi notre modèle dans lequel Spa33 est impliqué dans la régulation de la hiérarchie de la sécrétion lors de l'activation du SST3. En conclusion, nos résultats fournissent de nouvelles informations sur la régulation de la hiérarchie de sécrétion du SST3 et identifient de nouveaux acteurs impliqués dans cette régulation ouvrant de nouvelles perspectives dans la compréhension, et donc dans la lutte, contre une arme de virulence retrouvée chez plus de 25 pathogènes.