par Saliba, Elie 
Président du jury Vanhamme, Luc
Promoteur André, Bruno
Publication Non publié, 2017-12-20
Président du jury Vanhamme, Luc
Promoteur André, Bruno
Publication Non publié, 2017-12-20
Thèse de doctorat
| Résumé : | Chez les eucaryotes, le complexe kinase TORC1 (Target Of Rapamycin Complex 1) joue un rôle central dans le contrôle de la croissance cellulaire. Il intègre de nombreux signaux et agit en modulant l’état de phosphorylation de différents effecteurs, principalement des protéines impliquées dans des processus anaboliques ou cataboliques. Parmi ces signaux, on distingue notamment les acides aminés. Ces derniers agissent sur TORC1 via l’action de protéines de la famille des GTPases Rag, elles-mêmes régulées par des facteurs GEF et GAP. Des études récentes sur des cellules mammifères ont mis en évidence l’existence de senseurs d'acides aminés, capables de moduler l'activité des facteurs GEF et GAP. Chez la levure, ces senseurs restent toutefois inconnus. Chez la levure, TORC1 contrôle la fonction de plusieurs protéines y compris des transporteurs d'acides aminés de la membrane plasmique, comme la perméase générale des acides aminés, Gap1. C’est via sa branche de signalisation Tap2-PP2A/Npr1 que TORC1 contrôle l'ubiquitylation et le trafic intracellulaire de ces transporteurs, et ceci, en modulant l’activité d’adaptateurs de type α-arrestine de l'ubiquitine-ligase Rsp5.Dans ce travail, nous avons combiné des approches de génétique et de biochimie chez la levure afin d’étudier la régulation de TORC1 et son rôle dans l'endocytose en réponse au substrat de Gap1, la perméase générale des acide aminés, et de Can1, la perméase spécifique de l'arginine.Dans la première et la deuxième partie de ce travail, je décris ma contribution à l'étude qui visait à élucider le mécanisme d'ubiquitylation de Gap1 et de Can1 induite par le transport de leurs substrats. Le modèle déduit de ce travail propose que cette régulation négative n'est pas due à l'accumulation intracellulaire des acides aminés transportés, mais à un changement conformationnel des perméases, couplé à la réaction de transport et qui fait apparaitre un état ouvert vers l'intérieur, entraînant ainsi le remodelage de la queue cytoplasmique N-terminale et en conséquence l’exposition d'un site de liaison caché pour des adaptateurs de Rsp5 de type α-arrestine. Dans le cas de Can1, l'α-arrestine principale impliquée est Art1 et doit être stimulée via TORC1. Cependant, les α-arrestines Bul1/2, impliquées dans la régulation négative de Gap1, sont capables de promouvoir son ubiquitylation induite par le transport de substrat, qu'elles aient ou non été stimulées via TORC1. Nous fournissons également des preuves que d'autres perméases d'acides aminés spécifiques (Mup1, Lyp1) sont régulées par leurs propres substrats d'une manière similaire à Can1.Dans la dernière partie de ce travail, nous avons étudié le mécanisme par lequel le transport des acides aminés chez la levure stimule l'activité de TORC1 via les GTPases Rag, Gtr1 et Gtr2. En analysant en Western Blot l’état de phosphorylation de Npr1 et Sch9, deux kinases effectrices de TORC1, nous avons révélé que le signal général qui déclenche l'activation Gtr-dépendante de TORC1 est le flux de H+ couplé au transport des acides aminés généré par des symporteurs H+/acide-aminés. Dans ce contexte, nous avons identifié la pompe à H+ de la membrane plasmique, Pma1, comme étant un régulateur essentiel de l'activité de TORC1. L'activité de transport de Pma1 étant elle-même stimulée par une augmentation des protons cytosoliques, nous suggérons que Pma1 module TORC1 par un effet de signalisation.Collectivement, nos résultats fournissent de nouvelles perspectives sur le rôle central de TORC1 dans le contrôle des transporteurs de nutriments chez la levure. |
| The Target of Rapamycin Complex 1 (TORC1) plays a pivotal role in controlling cell growth in probably all eukaryotic organisms. It operates by integrating upstream signals like growth factors and nutrients to modulate by phosphorylation multiple downstream effectors, mostly proteins involved in anabolic or catabolic processes. Among the various signals that impinge on TORC1, nitrogen sources, in particular amino acids are primordial input signals modulating TORC1 activity through the conserved Rag family of GTPases. Recent studies in mammals have shed the light on the existence of various sensor systems of internal amino acids that modulate the activity of the GEF and GAP factors acting on the Rag GTPases. Yet, in yeast the amino acid sensing events acting upstream of the Rag GTPase (named Gtr1 and Gtr2) regulators remain poorly known. Yeast TORC1 controls the function of many proteins including several plasma membrane amino acid transporters, e.g., Gap1, the general amino acid permease. It does so via the Tap2-PP2A/Npr1-signaling branch that controls the ubiquitylation and intracellular trafficking of these proteins through regulation of α-arrestin-type adaptors of the ubiquitin-ligase Rsp5. In this work, we combined yeast genetics and biochemical assays to study TORC1 regulation by amino acids and to illustrate the role of TORC1 in substrate-transport mediated endocytosis of Gap1 and of the arginine specific permease, Can1. In the first and second part of this work, I describe my contribution to the study that aimed at elucidating the mechanism of substrate-transport-mediated ubiquitylation and endocytosis of Gap1 and Can1. The model deduced from this work states that this down-regulation is not due to intracellular accumulation of the transported amino acids, but to substrate-transport-induced conformational transition of the transporters to an inward-facing state, resulting in remodeling of their N-terminal cytoplasmic tail and subsequent exposure of a hidden binding site for α-arrestin-like adaptors of Rsp5. In the case of Can1, the main α-arrestin involved is Art1 and needs be stimulated via TORC1. The Bul1/2 α-arrestins involved in Gap1 down-regulation, however, are able to promote its substrate-transport-elicited ubiquitylation regardless of whether they have been stimulated via TORC1 or not. We also provide evidence that other specific amino acid permeases (Mup1, Lyp1) are regulated by their own substrates in a manner similar to Can1. In the last part of this work, we investigated how amino acid uptake by yeast cells triggers Rag/Gtr-dependent activation of TORC1. By assaying the phosphorylation on western blot of two TORC1-downstream effectors, the Npr1 and Sch9 kinases, we showed that uptake by Gap1 of ß-alanine, which cannot be used as a nitrogen source, unexpectedly stimulates TORC1 activity. Further analysis of this response allowed us to show that the general signal triggering Gtr-dependent activation of TORC1 in response to amino acid uptake is the influx of H+ coupled to transport via H+/amino-acid symporters. Furthermore, we identified Pma1, the H+-ATPase establishing the H+ gradient at the plasma membrane, as a central player of this control of TORC1 activity. As the transport activity of Pma1 itself is known to be stimulated by an increase of cytosolic protons, we suggest that Pma1 modulates TORC1 via signaling. Altogether, our results provide new insights on the central role of TORC1 in control of nutrient permeases in yeast. |
