par Triffaux, Eleonore 
Président du jury Reniers, François
Promoteur Buess Herman, Claudine
Co-Promoteur Doneux, Thomas
Publication Non publié, 2015-09-10
Président du jury Reniers, François
Promoteur Buess Herman, Claudine
Co-Promoteur Doneux, Thomas
Publication Non publié, 2015-09-10
Thèse de doctorat
| Résumé : | Ce travail porte sur l’étude électrochimique et par microscopie de fluorescence in situ de l’auto-assemblage, sur électrode d’or, de monocouches d’aptamères peptidiques de la protéine p53 en vue de la détection de la protéine MDM2. L’utilisation de nouvelles sondes de reconnaissance moléculaire telles que les aptamères peptidiques a été considérée en tant qu’alternative à l’utilisation d’anticorps. Les aptamères peptidiques sont des séquences synthétiques de peptide se liant à la protéine cible avec une affinité et une spécificité élevées. La première partie de ce travail porte sur l’étude électrochimique de l’interface modifiée résultant de diverses procédures d’immobilisation. Des mesures en présence du marqueur rédox [Ru(NH3)6]3+ ont démontré l’immobilisation de la sonde peptidique à la surface d’or et ont permis l’évaluation relative de la densité de sondes adsorbées à la surface respectivement à la méthode d’immobilisation considérée. Par ailleurs, des mesures en présence du couple rédox [Fe(CN)6]3-/4- ont mis en évidence une inhibition drastique du transfert d’électron dans le cas de monocouches composées exclusivement du peptide. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à la détection de la protéine MDM2. Trois interfaces modifiées ont été envisagées soit deux monocouches mixtes de peptide et de 4-mercaptobutan-1-ol, ce dernier jouant le rôle de diluant, adsorbés en une ou en deux étape(s), et une monocouche uniquement composée de peptide. L’utilisation de la spectroscopie d’impédance électrochimique en présence du couple rédox [Fe(CN)6]3-/4- comme méthode de détection a mis en exergue la pertinence de cette dernière interface pour la détection. En effet, l’inhibition du transfert d’électron préalablement identifiée est fortement amoindrie suite à l’interaction avec la protéine cible. Une gamme de détection s’étendant de ~1 à 60 ng mL-1 et une limite de détection de 0,69 ng mL-1 ont été obtenues. Cette performance est comparable à celle des kits ELISA commerciaux. La fiabilité et la spécificité de la réponse ont été vérifiées par le biais de contrôles négatifs sur trois protéines, en l’occurrence le fibrinogène, le cytochrome c et l’albumine de sérum bovin, et validées par des mesures complémentaires de microbalance à cristal de quartz.La troisième partie de ce travail est consacrée à l’étude, par microscopie de fluorescence in situ, de l’organisation de la monocouche résultant des trois procédures d’auto-assemblage précitées. Ces mesures ont permis la mise en évidence d’une distribution hétérogène de la densité en sondes, et plus particulièrement la présence d’agrégats. Ceux-ci ne peuvent être désorbés de la surface par l’application de potentiels même très négatifs (-1,450 V vs Ag |
