Etude des lymphocytes régulateurs en condition allogénique: effet pro-Th17 et impact du blocage B7-CD28

Immune homeostasis relies on a subtle balance between fight towards pathogens and inhibitory mechanisms that prevent inappropriate responses against self and environmental antigens (allergy). Regulatory T (Treg) cells play a central role in this balance. Optimizing Treg effects represents a promising approach for new stratetiges aiming to induce or restore tolerance against allo or self antigens. The first part of this work demonstrates that CD4+ lymphocytes that secrete IL-17A (Th17) promote allograft rejection in a murin model of skin transplantation with minor antigen disparities. Interestingly, Treg cells strengthen rather than inhibit Th17 effector mechanisms in this model. Indeed, we found that in vivo Treg depletion prevented IL-17 production by recipient T cells. An adoptive cotransfer of Treg with naive monospecific antidonor T cells in lymphopenic hosts biased the immune response towards a dominant Th17 phenotype. Finally, we observed that IL-6 was central for balancing Treg and Th17 cells as demonstrated by the prevention of Th17 differentiation, the enhanced Treg/Th17 ratio, and rejection blockade in the absence of IL-6. In conclusion, the ability of Treg to promote a Th17 pathway of rejection we described should be considered as a potential drawback of Treg-based cell therapy.

Based on the hypothesis that Treg promote Th17 immune response, we tested the effect of IL-17A neutralization in a model in which long-term skin allograft survival depends on a transient in vivo Treg expansion induced by exogenous IL-2. As expected, IL-2 administration prevented rejection of MHC class II disparate skin allografts. Surprisingly this treatment was inefficient in IL17A-/- recipients. We attested that IL-17A was not required for IL-2-mediated Treg expansion, recruitment or suppressive capacities. Instead, IL-17A prevented allograft rejection by inhibiting Th1 alloreactivity independently of Treg. Indeed, T-bet expression of naïve alloreactive CD4+ T cells and the subsequent Th1 immune response was significantly enhanced in IL-17A deficient mice. Our results illustrate, to our knowledge, for the first time a protective role of IL-17A in CD4+-mediated allograft rejection process.

In the last part of this work, we used the same mouse model of MHC class II-mismatched skin grafts in which long-term acceptance is achieved by a short-term administration of exogenous IL-2. We first confirmed that Tregs play a central role in preventing skin graft rejection as attested by the prompt donor skin destruction occuring after Treg cell depletion.

In the context of IL-2-mediated anti-rejection therapy, concomitant costimulatory blockade with CTLA4-Ig paradoxically restored skin allograft rejection and Th1 alloreactivity indicating that Treg-mediated suppresion absolutely required CD28-B7 or CTLA4/B7 interactions. Further experiments showed that CTLA4-Ig inhibited IL-2-driven Treg expansion, and prevented in particular the occurrence of ICOS+ Treg endowed with potent suppressive capacities. Restoring CD28 signaling was sufficient to counteract the deleterious effect of CTLA4-Ig on Treg expansion and functionality, in keeping with the hypothesis that costimulatory blockade inhibits Treg expansion and function by limiting the delivery of essential CD28-dependent signals. Inhibition of regulatory T cell function should therefore be taken into account when designing tolerance protocols based on costimulatory blockade.

RÉSUMÉ

Le bon fonctionnement du système immunitaire résulte d’un équilibre entre les réponses immunes « effectrices » qui luttent contre les pathogènes et des mécanismes « régulateurs » permettant de les contrôler. Parmi ces mécanismes inhibiteurs, les lymphocytes T régulateurs (Treg) jouent un rôle crucial. En empêchant le débordement des réponses effectrices, ils préviennent l’apparition des allergies et des maladies auto-immunes ou inflammatoires. Dès lors, il est aisé d’imaginer le potentiel thérapeutique de ces cellules pour contrecarrer les phénomènes autoimmuns ou les réponses allogéniques responsables du rejet en transplantation. C’est donc l’étude des Treg chez la souris qui se trouve au centre des nos préoccupations dans ce travail.

Dans la première partie, nous avons démontré le rôle des lymphocytes CD4+ sécréteurs d’IL-17A (Th17) dans le rejet de greffe de peau présentant une disparité d’antigène mineur de transplantation. Dans ce modèle de rejet « Th17 », les données indiquent que, contrairement aux lignées Th1 et Th2, la réponse Th17 est favorisée par les Treg renversant ainsi le paradigme absolu du « Treg inhibiteur ». En effet, la déplétion des Treg dans notre modèle abolit l’expression des gènes caractéristiques de la voie Th17. De plus, dans un système de transfert adoptif chez la souris lymphopénique, l’ajout de Treg à une population T CD4+ effectrice naïve favorise leur différenciation en Th17. Enfin, en invalidant le gène de l’IL-6 dans notre combinaison allogénique mineure, nous avons mis en évidence la place importante de cette cytokine dans le rejet Th17 ainsi que dans la balance Th17/Treg en alloimmunité.

En partant du postulat que les Treg favorisent les réponses Th17, nous avons étudié l’impact de la déficience en IL-17A dans un modèle de greffe de peau réalisée en présence de quatités acrues de Treg. Pour cela, nous avons utilisé un modèle de rejet induit par une disparité isolée du CMH II au cours duquel les Treg sont amplifiés par l’injection d’IL-2 exogène durant les trois premiers jours de greffe. Dans ce système, l’expansion transitoire des Treg chez le receveur « sauvage » bloque le rejet dans 75% des cas jusqu’au jour 60 après la greffe sans le moindre traitement immunosuppresseur. Contre toute attente, l’absence d’IL-17A dans ce système restaure le rejet (receveurs IL-17A-/-). Nous avons démontré que l’IL-17A n’est pas requise pour l’expansion, la migration ou la fonction des Treg amplifiés par l’IL-2. En fait, les résultats suggèrent que l’IL-17A bloque le rejet en inhibant la réponse Th1 indépendamment des Treg. Ce point est appuyé par l’exacerbation de la voie Th1 chez le receveur IL-17A-/- et l’inhibition de l’expression de T-bet sous l’influence de l’IL-17A en culture mixte lymphocytaire. Paradoxalement, cette partie du travail rapporte donc un effet protecteur de l’IL-17A illustrant toute la complexité des rôles joués par cette cytokine.

La dernière partie du travail utilise le même modèle de greffe de peau allogénique (disparité du CMH II) dans lequel le rejet aigu est bloqué par l’expansion in vivo des Treg induite par l’IL-2 exogène. Nous avons confirmé que l’acceptation à long terme des greffons repose sur les propriétés inhibitrices des Treg amplifiés. Cette inhibition du rejet nécessite impérativement l’intégrité des interactions survenant entre les Treg et les cellules présentatrices d’antigènes du receveur via les molécules B7/CD28. L’ajout de CTLA4-Ig, un immunosuppresseur bloquant les interactions de ces molécules, conduit invariablement à l’accélération paradoxale du rejet. Cet effet pro-inflammatoire du CTLA4-Ig, s’explique par une action délétère sur la survie et la qualité des Treg. En conclusion, les données expérimentales obtenues dans ce dernier volet démontrent l’effet délétère potentiel de ce type de traitement dans les protocoles d’induction de tolérance basé sur l’emploi des Treg.