Stabilization and development of sustained-release formulations of protein/antibody for subcutaneous delivery

This project aimed at developing a drug delivery system (DDS) able to enhance the stability and

residence time in vivo of antibodies (Abs). The system will deliver drug by the subcutaneous

route (SC), while ensuring accurate control of the drug release and the resulting plasmatic level. This technology platform will allow to reduce frequency of injection, potentially decrease side effects and maintain high concentration of Abs which will improve life of patient having chronic disease such as autoimmune and inflammatory disease. Biodegradable synthetic polymer-based formulations (polylactide-co-glycolide (PLGA)) were selected as carriers for encapsulated Abs. This was because they offer good protection for the Abs and allow sustained release of the Abs for a controlled period of time. After the evaluation of different encapsulation methods such as the water-oil-in-water (w/o/w) and the solid-in-oil-inwater

(s/o/w) processes, the encapsulation of the Ab in solid state (s/o/w) appeared to be more appropriate for producing Ab-loaded PLGA microspheres (MS). It allowed us to maintain the

Ab in a monomeric conformation and to avoid the formation of unsoluble aggregates mainly present at the water/oil interface. The first part of the project was the optimization of both the method for producing the Ab solid particles (spray-drying process) and the encapsulation of these Ab solid particles into the polymeric MS (s/o/w process) by design of experiment (DoE). These optimizations were carried out using a bovine polyclonal immunoglobulin G (IgG) as model molecule. In further optimization of the spray-drying process by (DoE), aqueous Ab solutions were spray-dried using a mini Spray-Dryer assembly with a 0.7 mm spray nozzle. In accordance with the particle size (d(0.5) ~5 μm), the stability (no loss of monomer measured by

size exclusion chromatography (SEC) and the yield of the spray-drying process (> 60 % w/w), the process parameters were set of follow: 3 mL/min as liquid feed flow rate, 130°C /75°C as inlet temperature (inlet T°) / outlet temperature (outlet T°), 800 L/h as atomization flow rate and

30 m3/h as drying air flow rate. For the s/o/w, the methylene chloride (MC) commonly used for

an encapsulation process was replaced by ethyl acetate (EtAc), which was considered as a more

suitable organic solvent in terms of both environmental and human safety. The effects of several processes and formulation factors were evaluated on IgG:PLGA MS properties such as: particle size distribution, drug loading, IgG stability, and encapsulation efficiency (EE%). Several formulations and processing parameters were also statistically identified as critical to get reproducible process (e.g. the PLGA concentration, the volume of the external phase, the emulsification rate, and the quantity of IgG microparticles). The optimized encapsulation

method of the IgG has shown a drug loading of up to 6 % (w/w) and an encapsulation efficiency

of up to 60 % (w/w) while preserving the integrity of the encapsulated antibody. The produced MS were characterized by a d(0.9) lower than 110 μm and showed burst effect lower than 50 %(w/w). In the second part of the project, the optimized spray-drying and s/o/w processes

developed with the IgG were applied to a humanized anti-tumor necrosis factor (TNF) alpha

MAb to confirm the preservation of the MAb activity during these processes. The selected s/o/w method allowed us to produce MAb-loaded PLGA MS with an appropriate release profile up to 6 weeks and MAb stability. In order to maintain the Abs’ activity, both during encapsulation and

dissolution, the addition of a stabilizer such as trehalose appeared to be crucial, as did the

selection of the PLGA. It was demonstrated that the use of a PLGA characterized by a 75:25

lactide:glycolide (e.g. Resomer ® RG755S) ratio decreased the formation of low molecular weight species during dissolution, which led to preserve Abs activity through its release from the

delivery system. Furthermore, the release profile was adjusted according to the type of polymer

and its concentration. E.g. 10 % w/v RG755S allowed Ab MS with a release time of 6 weeks to

be obtained. The optimization of both the formulation and the encapsulation process allowed

maximum 13 % w/w Ab-loaded MS to be produced. It was demonstrated that the Ab-loaded PLGA MS were stable when stored at 5°C for up to 12 weeks and that the selection of the appropriate type of PLGA was critical to assuring the stability of the system. The better stability observed when using a PLGA characterized by a 75:25 lactide:glycolide ratio was attributed to

its slower degradation rate. Finally, the sustained release of Ab from the developed MS and the preservation of its activity was confirmed in vivo in a pharmacokinetic (pK) study realized in

rats. In conclusion, the application of the concept of entrapment into a polymer matrix for

stabilization and sustained release of biological compounds was demonstrated through this work.

RÉSUMÉ

Ce projet a pour but de développer un système de délivrance de médicament capable d’augmenter la stabilité et le temps de résidence in vivo des anticorps. Ce système sera administré par voie sous-cutanée et permettra un control précis de la libération du produit et de son niveau plasmatique. Cette plateforme technologique nous permettra de réduire la fréquence d’injection, de réduire potentiellement les effets secondaires et de maintenir des concentrations élevées en anticorps tout en améliorant la vie des patients atteints de maladies chroniques autoimmunes ou inflammatoires. Les formulations à base de polymères synthétiques, biodégradables (PLGA) ont été sélectionnés comme véhicules pour encapsuler les anticorps. Ils offrent en effet une bonne protection pour les anticorps and permettent une libération contrôlée de ceux-ci pendant une période définie. Après l’évaluation de différents méthodes d’encapsulation tels que les procédés d’eau-dans-huile-dans-eau (w/o/w) et solide-dans-huile-dans-eau (s/o/w), l’encapsulation des anticorps sous forme solide apparaissait plus apporpriée pour produire des microsphères de polymère chargées en anticorps. Cette technique nous permettait de maintenir l’anticorps sous sa forme monomérique et d’éviter la formation d’agrégats insolubles qui apparaissaient principalement à l’interface eau/huile. La première partie du projet a été d’optimiser à la fois la méthode nous permettant d’obtenir les anticorps sous forme de particules solides (spray-drying) et la méthode d’encapsulation de ces particules d’anticorps dans les microsphères de polymères. Cela a été réalisé par des plans d’expérience en utilisant une IgG bovine polyclonale comme molécule modèle. Durant l’optimisation du procédé de spray-drying,

les solutions aqueuses d’anticorps ont été atomisées en utilisant le mini Spray-Dryer assemblé avec une buse de pulvérisation d’un diamètre de 0.7 mm. En accord avec la taille particulaire (d(0.5) ~5 μm), la stabilité (absence de perte en monomère mesurée par chromatographie d’exclusion de taille et le rendement d’atomisation (> 60 % w/w), les paramètres d’atomisation ont été fixés: 3 mL/min pour le débit de liquide, 130°C /75°C pour la température d’entrée / température de sortie, 800 L/h pour le débit d’air d’atomisation et 30 m3/h pour le débit d’air de séchage. Pour le s/o/w, le dichlorométhane communément utilisé dans les procédés d’encapsulation a été remplacé par l’acétate d’éthyle qui est considéré comme un meilleure solvant organique en terme d’environnement et de sécurité. Les effets de plusieurs paramètres de fabrication ou de formulation ont été évalués sur les propriétés des microsphères polymériques d’anticorps (distribution de taille particulaire, taux de charge en anticorps, stabilité de l’anticorps et efficacité d’encapsulation). Plusieurs paramètres de fabrication et de formulation ont été statistiquement identifiés comme critiques pour obtenir un procédé reproductible (par exemple. La concentration en PLGA, le volume de phase externe, la vitesse d’émulsification et la quantité d’anticorps). La méthode d’encapsulation ainsi optimisée permettait d’obtenir un taux

de charge jusqu’à 6% (w/w) avec une efficacité d’encapsulation jusqu’à 60 % (w/w) tout en

préservant l’intégrité de l’anticorps encapsulé. Les microsphères produites étaient caractérisées

par un d(0.9) inférieur à 110 μm et montraient une libération après 24 h inférieure à 50 % (w/w).

Dans le seconde partie du projet, les procédés d’atomisation et d’encapsulation développés avec

l’IgG ont été appliqués à un anticorps monoclonal anti-TNF alpha humanisé pour confirmer la

conservation de l’activité de l’anticorps pendant ces procédés. La méthode s/o/w sélectionnée

permettait de produire des microsphères de PLGA chargées en anticorps avec un profil de libération jusqu’à 6 semaines et un maintien de la stabilité de l’actif. Afin de maintenir l’activité de l’anticorps, à la fois pendant le procédé d’encapsulation et pendant la libération, l’ajout d’un stabilisant tel que le tréhalose est apparu crucial ainsi que le choix du type de PLGA. Il a été démontré que l’utilisation du PLGA caractérisé par un ratio lactide :glycolide de 75 :25 (par exemple, Resomer ® RG755S) diminuait la formation d’espèces de faible poids moléculaire

pendant la dissolution. Cela contribuait à préserver l’activité de l’anticorps durant la libération à partir des microsphères. De plus, le profil de libération était modulé en fonction du type de polymère et de sa concentration. Par exemple, l’utilisation d’une solution à 10 % w/v RG755S conduisait à la production de microsphères d’anticorps avec un temps de libération sur 6

semaines. L’optimisation de la formulation et du procédé d’encapsulation a permis de produire

des microsphères avec des taux de charge en anticorps de maximum 13 % w/w. Il a été démontré

que ces microsphères, stockées à 5°C, étaient stables jusqu’à 12 semaines et que la sélection du

type de PLGA était critique pour assurer la stabilité du système. La meilleure stabilité a été

obtenue en utilisant le PLGA caractérisé par un ratio lactide :glycolide de 75 :25. Cela a été

attribué à sa plus faible vitesse de dégradation. Enfin, la libération contrôlée de l’anticorps à

partir de ces microsphères et la conservation de son activité ont été confirmées in vivo lors d’une

étude pharmacocinétique réalisée chez le rat. En conclusion, ce travail a permis de démontrer

l’application du concept d’ « emprisonnement » des composés biologiques dans des matrices

polymériques afin de les stabiliser et contrôler leur libération.