Structure-function relationship studies on the tRNA methyltransferases TrmJ and Trm10 belonging to the SPOUT superfamily

In the first part of this work we have identified the TrmJ enzyme of Sulfolobus acidocaldarius (the model organism of hyperthermophilic Crenarchaeota) which 2’-O-methylates the nucleoside at position 32 of tRNAs. This protein belongs to the SPOUT superfamily and is homologous to TrmJ of the bacterium Escherichia coli. A comparative study shows that the two enzymes have different specificities for the nature of the nucleoside at position 32 as well as for their tRNA substrates. To try to understand these shifts of specificity at a molecular level we solved the crystal structure of the SPOUT domains of the two TrmJ proteins.

In the second part of this work, we have determined the crystal structure of the Trm10 protein of S. acidocaldarius. This is the first structure of a 1-methyladenosine (m1A) specific Trm10 and also the first structure of a full length Trm10 protein. The Trm10 protein of S. acidocaldarius is distantly related to its yeast homologues which are 1-methylguanosine (m1G) specific. To understand the difference of activity between the Trm10 enzymes, we compared the yeast and the S. acidocaldarius Trm10 structures. Remarkably several Trm10 proteins (such as Trm10 of Thermococcus kodakaraensis) are even able to form both m1A and m1G. To understand the capacity of the T. kodakaraensis protein to methylate A and G, a mutational study was initiated./Lors de la traduction, les ARN de transfert (ARNt) jouent le rôle crucial d’adaptateurs entre l’ARN messager et les acides aminés. Les ARNt sont transcrits sous forme de pré-ARNt qui doivent être maturés. Lors de cette maturation, plusieurs nucléosides sont modifiés. Un grand nombre de ces modifications sont des méthylations des bases ou du ribose. Quatre familles d’ARNt méthyltransferases sont actuellement connues, dont la superfamille des SPOUT. Les membres de cette superfamille sont caractérisés par un nœud dans la chaîne polypeptidique du côté C-terminal. C’est au niveau de ce nœud que se lie la S-adénosylméthionine qui est le donneur de groupement méthyle. A l’exception de Trm10 qui est monomérique, toutes les protéines SPOUT connues sont dimériques et leur site actif est formé de résidus provenant des deux protomères. Selon l’espèce, une même modification peut être formée à la même position dans la molécule d’ARNt par des enzymes qui appartiennent à des familles différentes. A l’opposé, des enzymes homologues peuvent présenter des spécificités ou des activités différentes.

Au cours de ce travail, nous avons identifié l’enzyme TrmJ de Sulfolobus acidocaldarius (l’organisme modèle des Crénarchées hyperthermophiles) qui méthyle le ribose du nucléoside en position 32 des ARNt. Cette protéine est un homologue de l’enzyme TrmJ de la bactérie Escherichia coli. L’étude comparative que nous avons réalisée a révélé que ces deux enzymes présentent une différence de spécificité pour la nature du nucléoside en position 32 ainsi que pour les ARNt substrats. Afin de comprendre ces différences de spécificité au niveau moléculaire, les structures des domaines SPOUT des deux TrmJ ont été déterminées et comparées.

En parallèle, nous avons résolu la structure cristalline de la protéine Trm10 de S. acidocaldarius. C’est la première structure disponible d’un enzyme Trm10 formant de la 1-méthyladénosine (m1A). C’est aussi la première structure complète d’une protéine Trm10. Les enzymes homologues des levures Saccharomyces cerevisiae et Schizosaccharomyces pombe qui n’ont que peu d’identité de séquence avec l’enzyme de S. acidocaldarius, forment de la 1-méthylguanosine (m1G). Dans le but de comprendre comment ces enzymes homologues peuvent présenter des activités différentes, leurs structures ont été comparées. De manière surprenante, certains homologues de Trm10 (comme l’enzyme de l’Euryarchée Thermococcus kodakaraensis) sont capables de former du m1A et du m1G. Afin de mieux comprendre comment ces protéines sont capables de méthyler deux types de bases, nous avons initié l’étude de l’enzyme Trm10 de T. kodakaraensis par mutagenèse dirigée.