Identification and functional characterization of trans-acting factors required for eukaryotic ribosome synthesis

In the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, it has been reported recently that the processing of the 35S nascent transcript and the assembly of pre-ribosomes occur concomitantly with Pol I transcription in the nucleolus. In this process, the growing Pol I transcript gradually assembles with pre-40S structural ribosomal proteins and ribosomal synthesis factors to form the so-called ‘SSU-processome’ or ‘90S pre-ribosome’, the earliest precursor of the 40S subunit. The SSU-processome/90S pre-ribosome localizes to the nucleolus and consists of the 35S pre-rRNA, the U3 small nucleolar (sno) RNA, about a dozen of 40S ribosomal proteins and more than forty ribosome synthesis factors. The U3 snoRNA and pre-40S ribosome synthesis factors are all implicated in the processing of the 35S precursor (at sites A0, A1 and A2) and therefore in the synthesis of the 18S rRNA component of the 40S subunit. Significantly, the association of the U3 snoRNA with the growing 35S transcript is important for pre-40S assembly, whereas its dissociation from the processed transcript (following cleavage at sites A0-A2) is crucial for the overall structural remodeling of the 18S rRNA and for the formation of pre-40S ribosomes from the earliest precursor 90S particles.

This thesis mostly addresses the identification and functional characterization of Esf2 and Bfr2, two novel 40S synthesis factors, components of the SSU-processome/90S pre-ribosome in yeast. Both proteins localize to the nucleolus and their genetic depletions lead to failure in the production of 40S subunits. In the absence of either factor, the 35S pre-rRNA is not processed at sites A0-A2 and the 18S rRNA is not synthesized. Also, pre-ribosome assembly is affected and pre-40S ribosomes fail to mature properly. Strikingly, in the absence of either factor, the U3 snoRNA remains associated with unprocessed 35S transcript within pre-ribosomes indicating that Esf2 and Bfr2 are required to dissociate U3 from pre-ribosomes. This process also involves RNP (ribonucleoprotein particle) unwinding activities of the putative RNA helicase Dbp8.

La biogenèse du ribosome eucaryote est un processus complexe qui consomme beaucoup d’énergie et implique plusieurs centaines de facteurs trans qui s’associent de manière transitoire avec les pré-ribosomes en cours de formation. La biogenèse des sous-unités ribosomiques (la petite sous-unité 40S et la grande sous-unité 60S) débute dans le nucléole par la synthèse d’un long précurseur d’ARN ribosomique (le pré-ARNr, dit 35S chez la levure Saccharomyces cerevisiae) par l’ARN Polymérase I (Pol I). Ceci constitue une étape clé dans le contrôle global de la synthèse du ribosome chez la levure. Le pré-ARNr 35S renferme les séquences des ARNr matures 18S (ARNr de la sous-unité 40S) et 5.8S et 25S (deux des trois ARNr de la sous-unité 60S). Le pré-ARNr 35S subit un long processus de maturation et d’assemblage au cours duquel il est modifié, clivé (on parle du « processing » du pré-ARNr) et s’assemble avec des protéines ribosomiques (« RP », composants structuraux des sous-unités ribosomiques matures) et de nombreux facteurs de synthèse (facteurs trans) pour former différentes particules pré-ribosomiques (précurseurs des sous-unités 40S et 60S).

Chez la levure S. cerevisiae, il a récemment été montré que le processing du pré-ARNr 35S et l’assemblage des pré-ribosomes se produisent de manière concomminante avec la transcription Pol I dans le nucléole. Ainsi, le transcrit Pol I en cours de synthèse s’assemble progressivement avec des facteurs de synthèse ainsi que des RP pour former le « SSU processome » ou « pré-ribosome 90S », tout premier précurseur de la petite sous-unité 40S. Le SSU processome/pré-ribosome 90S est localisé dans le nucléole et est consisté du pré-ARNr 35S naissant, du petit ARN nucléolaire (snoRNA) U3, d’une douzaine de RP de la petite sous-unité 40S et de plus de 40 facteurs de synthèse. Le snoRNA U3 et ces facteurs de synthèse sont tous impliqués dans les clivages du pré-ARNr 35S aux sites A0, A1 et A2, et donc dans la biogenèse de l’ARNr 18S. L’association du snoRNA U3 avec le pré-ARNr 35S naissant est importante pour l’assemblage du SSU processome/pré-ribosome 90S. Par ailleurs, sa dissociation après les clivages aux sites A0-A2 permet un remodelage structural général de l’ARNr 18S et la formation du « pré-ribosome 40S » à partir de la particule précoce 90S.

Au cours de cette thèse, nous avons identifié et caractérisé fonctionnelement chez la levure deux nouveaux facteurs de synthèse de la petite sous-unité 40S et composants du SSU processome/pré-ribosome 90S: Esf2 et Bfr2. Ces deux protéines sont localisées dans le nucléole. Leur déplétion entraîne une incapacité à produire la sous-unité ribosomique 40S. En l’absence d’Esf2 ou Bfr2, le pré-ARNr 35S n’est plus clivé aux sites A0-A2 et l’ARNr 18S mature n’est plus produit. L’assemblage des pré-ribosomes est aussi affecté, notamment la formation du pré-ribosome 40S. De manière importante, en l’absence de l’un ou l’autre de ces facteurs, le snoRNA U3 reste associé au pré-ARNr 35S non clivé au sein des pré-ribosomes, indiquant qu’Esf2 et Bfr2 sont requises pour la dissociation d’U3 des pré-ribosomes. Ce processus implique aussi Dbp8, une hélicase à ARN présumée.